罗格列酮对肺成纤维细胞增殖的影响

2024年2月3日发(作者：)

第31卷　第2期2021年2月CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINE中国比较医学杂志February,2021Vol.31　No.2史方海,陈忠仁.罗格列酮对肺成纤维细胞增殖的影响[J].中国比较医学杂志,2021,31(2)::10.3969/.1671-7856.2021.02.014ShiFH,sofrosiglitazoneontheproliferationofpulmonaryfibroblasts[J].ChinJCompMed,2021,31(2):93-97.罗格列酮对肺成纤维细胞增殖的影响史方海∗,陈忠仁(海口市人民医院呼吸内科,海口　570208)　　【摘要】　目的　探讨罗格列酮(RGZ)对肺成纤维HELF细胞增殖的影响,并探讨p38丝裂原活化蛋白组、低剂量RGZ(LD-RGZ)组和高剂量RGZ(HD-RGZ)组。CCK-8检测细胞增殖。流式细胞仪检测细胞周激酶(p38MAPK)通路在其中的作用。方法　HELF细胞培养于DMEM培养液中,实验分为:对照组、TGF-β1期。Westernblot检测蛋白表达。结果　24h、48h和72h时HD-RGZ组细胞增殖OD450值显著低于LD-RGZ组(P<0.05),LD-RGZ组又显著低于TGF-β1组(P<0.05)。对照组、TGF-β1组、LD-RGZ组和HD-RGZ组G1期细胞分别占细胞周期的(91.23±6.32)%、(70.35±4.14)%、(76.12±4.38)%和(82.35±5.16)%,各组间存在显著差异(P<0.05)。其中,HD-RGZ组G1期细胞比例显著高于LD-RGZ组(P<0.05),LD-RGZ组又显著高于TGF-β1组(P<0.05)。HD-RGZ组ColI、ColIII和P-p38MAPK蛋白显著低于LD-RGZ组(P<0.01),LD-RGZ组又显著低于TGF-β1组(P<0.01)。结论　罗格列酮抑制p38MAPK通路,进一步抑制肺成纤维细胞增殖以及胶原的合成。【关键词】　罗格列酮;肺成纤维细胞;p38丝裂原活化蛋白激酶通路;细胞周期【中图分类号】R-33　　【文献标识码】A　　【文章编号】1671-7856(2021)02-0093-05Effectsofrosiglitazoneontheproliferationofpulmonaryfibroblasts(DepartmentofRespiratoryMedicine,HaikouPeople’sHospital,Haikou570208)　　【Abstract】　Objective　Toobservetheeffectsofrosiglitazone(RGZ)ontheproliferationofHELFcells(humanSHIFanghai∗,CHENZhongrenembryoniclungfibroblast)andp38/s　lsweredividedintoacontrolgroup,TGF-β1group,lowdoseRGz(LD-RGZ)group,andhighdoseRGZ(HD-RGZ)-8wasusedtodetectcellproliferation,s　At24,48,and72h,theOD450valuesintheHD-RGZgroupweresignificantlylowerthanthoseintheLD-RGZgroup(P<0.05),andthoseintheLD-RGZgroupweresignificantlylowerthanthevaluesintheTGF-β1group(P<0.05).TheproportionofG1phasecellsinthecontrol,TGF-β,LD-RGZ,andHD-RGZgroupssignificantdifferenceamongthegroups(P<0.05).ThepercentageofG1phasecellsintheHD-RGZgroupwaswas(91.23±6.32)%,(70.35±4.14)%,(76.12±4.38)%,and(82.35±5.16)%,asasignificantlyhigherthanthatintheLD-RGZgroup(P<0.05),andtheproportionintheLD-RGZgroupwassignificantlyhigherthanthatintheTGF-β1group(P<0.05).TheproteinexpressionofColI,ColIII,andphospho-p38/MAPKingroupweresignificantlylowerthanthoseintheTGF-β1group(P<0.01).Conclusions　RGZcaninhibitthep38/[基金项目]海南省自然科学基金面上项目(818MS136)。[作者简介]史方海(1987—),男,本科,研究方向:呼吸内科。E-mail:hnhk2010@HD-RGZgroupwassignificantlylowerthanthatintheLD-RGZgroup(P<0.01),andthelevelsintheLD-RGZ

94中国比较医学杂志2021年2月第31卷第2期　ChinJCompMed,February2021,Vol.31,No.2MAPKpathwaytoimpairtheproliferationandcollagensynthesisofpulmonaryfibroblasts.【Keywords】　rosiglitazone(RGZ);pulmonaryfibroblasts;p38/MAPKpathway;cellcycle　阻塞性肺疾病或哮喘　肺纤维化是肺慢性炎症的主要危害,气道慢性炎症促使局部大量,例如慢性的促纤维化生长因子分泌[1]肌原成纤维细胞分化,重塑气道,成纤维细胞增生并向,诱发肺脏间质纤维化,最终导致患者肺功能的损害,可见阻止成纤维细胞增生以及气道重建是干预肺慢性炎症肺功能危害的关键[2]过氧proliferator-activated化物酶体增。殖罗格列酮物激活(受rosiglitazone,RGZ)体-γ(peroxisome是床使用中发现RGZ还具有具有抗炎receptor-γ,PPARγ)、调节免疫的功激动剂,临效[3]损伤,保有研究显示护作用[4-5]RGZ。p38可以抑制肺部炎症丝裂原活化蛋,白发挥肺(激酶路是生物体内重要的信号转导通路p38mitogen-activatedproteinki-nase,p38MAPK),在成纤维细胞通的增殖分化中也发挥着重要作用[6]了p38MAPKRGZ对通路在其中的作用肺成纤维细胞增。殖的。影本研究观察响,并探讨1　材料和方法1.1　实验细胞fibroblast,HELF)人胚肺成纤购自中国科学院上海细胞库维细胞株(humanembryonic。lung1.2　链霉RGZ主要试剂与仪器(PI)素、购自太极集团重庆涪陵制药厂;青霉素、青生物技术材料研究所购于美国转化生Sigma长因公司子-β1(TGF-β1)、碘化丙啶;胰蛋白酶;胎牛血清购自杭州四季、高糖DMEM干粉培养基(CCK购自美国Gibco公司;细液、Bradford-8)购自北京全式金生物技术公司胞计数试剂盒蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物技;蛋白裂解术公司III)、P-;ICruzp38MAPK、型胶原蛋白p38MAPK(ColI)、III抗体型胶原蛋白购自美国Santa(ColBeckmanThermo公司Fisher;MK3Coulter公多功能酶标仪公司产品司产品;流、式细胞培养箱为美国。细胞仪为美国1.1.3　3.1　实验方法HELF细胞培养和实验分组10%胎牛血清细、100胞于U37℃/mL、青霉素和5%CO2环100境下,培养于素的DMEM培养液中,细胞融合达80%mg~90%/mL链霉时胰酶消化传代。实验分为:对照组、TGF-β1组、低剂量RGZ(2L,HD-RGZ)mmol养液中RGZ和加HD-RGZ入组/L,LD-RGZ)[5]TGF-β1。对照组正常培养组和高剂量组培养液中加入至终浓度为,TGF-β1RGZ(4mmol组培/β11010μmolμmol//LL,TGF-LD-1.3.后2　,再分别加入对照组CCK、TGF-β1-8细胞增殖检测2mmol/L或4mmol/LRGZ。组、LD-RGZ组和HD-RGZ组细胞,4000个细胞/孔接种于96孔板,每组设6个复孔,置于细胞培养箱24h、24h、72h后,按照试剂盒说明书每孔加入10μLCCK-8液,继续培养4h1.后3.,测定波长3　细胞周期检测450nm处吸光度值即OD450值。对照组、TGF-β1组、LD-RGZ组和HD-RGZ组细胞,1×105个细胞/孔接种于6孔板,每组设6个复孔,24h后胰酶消化收集细胞,迅速注入4℃70%冷乙醇中固定24h,1000r/min离心5min,PBS缓冲液洗涤细胞3次,加入10μmol/LPI置冰上待测,流式细胞仪完成检测,仪器自带CellQuest软件1.进行细胞周期分析3.4　对照组Western、TGF-β1blot。检测蛋白表达组、LD-RGZ组和HD-RGZ组细胞,1×105个细胞/孔接种于6孔板,每组设6个复孔min,PBS,24h后胰酶消化收集细胞,1000r/min离心5μL后,蛋白裂解液缓冲液洗涤细胞每个样品取,使用3次,每个样品加入10010μgBradford蛋白进行蛋白定量试剂盒定量SDS-PAGE凝胶电泳,转印蛋白至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2h后,加入一抗,4℃孵育过夜,换二抗孵育2h,压片,显影,定影,用Image-J软件对照内参GAPDH蛋白p38MAPK,计算目的蛋白ColI、ColIII、P-p38MAPK1.4　统计学方法的相对灰度值。和采用SPSS17.0统计软件分析,多组均数间比较使用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2　结果2.1　RGZ对HELF细胞增殖的影响对照组、TGF-β1组、LD-RGZ组和HD-RGZ组细胞在24h、48h和72h时OD(P<0.05)。其中,24h、48h和450值存在显著差异72h时HD-

中国比较医学杂志2021年2月第31卷第2期　ChinJCompMed,February2021,Vol.31,No.295RGZ组OD450值显著低于LD-RGZ组(P<0.05),LD-RGZ组又显著低于TGF-β1组(P<0.05)。2.2　RGZ对HELF细胞周期的影响G1期细胞分别占细胞周期的(91.23±6.32)%、(70.35±4.14)%、(76.12±4.38)%和(82.35±HD-RGZ组G1期细胞比例显著高于LD-RGZ组(P0.05)。见图2。<0.05),LD-RGZ组又显著高于TGF-β1组(P<5.16)%,各组间存在显著差异(P<0.05)。其中,对照组、TGF-β1组、LD-RGZ组和HD-RGZ组见表1、图1。证实[8-9]。研究发现罗格列酮可以通过调控内皮素、一氧化氮等一些生物活性物质抑制心肌成纤维细胞增殖[10]。TGF-β1是刺激成纤维细胞增殖的常用细胞因子,并且研究已证实了TGF-β1的致纤维化功能[11],本研究显示HD-RGZ组细胞增殖的OD450值显著低于LD-RGZ组(P<0.05),LD-RGZ组β1诱导的HELF细胞增殖,而且随着RGZ剂量的组别Groups又显著低于TGF-β1组,说明了RGZ可以抑制TGF-表1　四组细胞OD450值的比较(n=6)Table1　ComparisonofOD450valuesoffourgroups24h48h2.3　RGZ对HELF细胞ColI和ColIII蛋白的影响RGZ组和HD-RGZ组细胞ColI和ColIII蛋白表达存在显著差异(P<0.01)。其中HD-RGZ组ColI和RGZ组又显著低于TGF-β1组(P<0.01)。从表2和图3可见,对照组、TGF-β1组、LD-72hColIII蛋白显著低于LD-RGZ组(P<0.01),LD-2.4　RGZ对HELF细胞p38MAPK通路的影响RGZ组和HD-RGZ组细胞p38MAPK蛋白表达无显著性差异(P>0.05),而P-p38MAPK蛋白表达存在显著性差异(P<0.01)。其中HD-RGZ组P-p38MAPK蛋白显著低于LD-RGZ组(P<0.01),LD-RGZ组又显著低于TGF-β1组(P<0.01)。3　讨论气道的慢性炎症导致间质成纤维细胞增殖,产生大量细胞外基质,重建气道是肺纤维的病理生理润、分泌致炎因子,拮抗气道炎症已被大多数实验从表2和图3可见,对照组、TGF-β1组、LD-HD-RGZ组HD-RGZgroupFPLD-RGZ组LD-RGZgroupTGF-β1组TGF-β1group对照组Controlgroup0.14±0.02∗0.32±0.04∗∗▲0.26±0.03∗∗▲▲#0.21±0.03∗0.33±0.05∗0.65±0.08∗∗▲0.52±0.06∗0.59±0.07∗1.02±0.11∗∗▲0.86±0.09∗0.42±0.05∗▲▲#4.0170.0310.70±0.08∗▲▲#4.2530.0243.7160.041∗注:与对照组比较,∗P<0.05,∗P<0.01;与TGF-β1组比较,▲▲▲P<0.05,P<0.01;与LD-RGZ组比较,#P<0.05。∗edwiththecontrolgroup,∗P<0.05,∗P<0.01.▲▲▲ComparedwithTGF-β1group,P<0.05,P

96中国比较医学杂志2021年2月第31卷第2期　ChinJCompMed,February2021,Vol.31,No.2表2　四组细胞ColI、ColIII、P-p38MAPK和p38MAPK蛋白的相对灰度值比较(n=6)Table2　ComparisonofrelativegrayvaluesofColI,colIII,P-P38MAPKandp38MAPKproteinsinfourgroups组别Groups对照组ControlgroupI型胶原蛋白ColI0.04±0.01∗0.75±0.11∗∗▲▲0.35±0.05∗∗▲▲##0.24±0.04∗III型胶原蛋白ColIII0.11±0.02∗0.78±0.12∗∗▲▲0.27±0.04∗∗▲▲##0.18±0.02∗磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶P-p38MAPK0.06±0.01∗0.62±0.10∗∗▲▲0.22±0.03∗∗▲▲##0.13±0.02∗p38丝裂原活化蛋白激酶p38MAPK0.84±0.120.83±0.130.86±0.140.82±0.100.1360.904##HD-RGZ组HD-RGZgroupFPLD-RGZ组LD-RGZgroupTGF-β1组TGF-β1group12.7130.0008.6240.0009.1150.000∗注:与对照组比较,∗P<0.01;与TGF-β1组比较,▲▲P<0.01;与LD-RGZ组比较,##P<0.01。∗edwiththecontrolgroup,∗P

中国比较医学杂志2021年2月第31卷第2期　ChinJCompMed,February2021,Vol.31,No.2[6]　郭晴,何振华.p38MAPK信号通路与肺纤维化[J].微生物学免疫学进展,2016,44(4):58-64.[7]　陈冉,王瑞.TGF-β1/MAPK信号转导通路与肺纤维化的关系[J].中国煤炭工业医学杂志,2016,19(9):1399-1403.[8]　钟莲娣,张春来,左万里,等.罗格列酮抑制慢性阻塞性肺疾病模型大鼠炎性反应的机制研究[J].中国呼吸与危重监护杂志,2018,17(3):230-236.[9]　张春来,黄炎明,钟莲娣.罗格列酮对慢性阻塞性肺疾病大鼠的抗炎作用[J].广东医学,2017,38(14):2119-2121.[10]　李洁,刘乃丰,魏芹.盐酸罗格列酮对糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖及分泌NO的影响[J].东南大学学报(医学版),2007,26(2):128-130.97[12]　BaoC,YangZ,CaiQ,entalloadtrainingimprovesrenalfibrosisbyregulatingtheTGFβ1/TAK1/MKK3/p38MAPKsignalingpathwayandinducingtheactivationofautophagyin[13]　王芳,江瑾,夏霖,等.PPARγ配体4i通过抑制NF-κB和MAPK信号通路抑制小鼠巨噬细胞炎性细胞因子的产生[J].细胞与分子免疫学杂志,2018,34(6):ce[J].IntJMolMed,2019,44(5):1677-1686.[14]　金玲,徐天华,王晓丽.罗格列酮对乳腺癌4T1细胞迁移侵2019,24(8):700-705.袭和p38MAPK信号通路的影响[J].临床肿瘤学杂志,[15]　NuwormegbeSA,SohnJH,-Gammaagonistfibroblastsbymodulatingthep38MAPKpathway[J].InvestOphthalmolVisSci,2017,58(12):5217-5226.[11]　ZhouY,JiJ,JiL,atoryexposuretonano-TiO2activatedTGF-β/Smad/p38MAPK/Wntpathways[J].JBiomedMaterResA,2019,107(11):itazonesuppressesfibroticresponseinhumanpterygiuminducespulmonarytoxicityinmiceinvolvingreactivefreeradical-〔收稿日期〕2020-07-01(上接第73页)[9]　KhoramzadehM,DehghanianA,fendothelinbreceptorsandendothelialnitricoxidesynthaseintheregulationPharmacol,2019,73(3):onaryhemodynamicincirrhoticrats[J].JCardiovasc[10]　胡建廷,邱波,英永,等.自发性肝硬化比格犬肝脏病理形态学研究[J].中国比较医学杂志,2016,26(12):55-58.[11]　CarvalhoMVH,KrollPC,KrollRTM,ticcardiomyopathy:theliveraffectstheheart[J].BrazJMedBiolRes,2019,52(2):e7809.[15]　王爱鱼,侯培珍.肝硬化所致心脏损害—附96例尸解分析[16]　PettaS,AdinolfiLE,FracanzaniAL,tisCviruseradicationbydirect-actingantiviralagentsimprovescarotidHepatol,2018,69(1):sclerosisinpatientswithsevereliverfibrosis[J].J[17]　QiX,GuoX,YoshidaEM,entportalvein[18]　McAvoyNC,SempleS,RichardsJM,entialvisceralcirrhosis[J].AlimentPharmacolTher,2016,43(9):osisinlivercirrhosis[J].BMCMed,2018,16(1):83.[J].中华消化杂志,1998,18(3):184-184.[12]　王立坤,张素梅,武雪亮,等.血浆钠尿肽联合Tei指数评估病毒性肝炎肝硬化患者心功能的临床研究[J].中国医药导报,2018,15(25):127-131.[13]　NyrnesSA,FadnesS,WigenMS,peckle-trackingbasedonhigh-framerateultrasoundimaginginpediatriccardiology[J].JAmSocEchocardiogr,2020,33(4):493[14]　KimHM,KimHK,LeeJH,dialstructuralandtransplantation:lowinthehyperdynamiccirculationofpatientswithliver[19]　SalvettiM,PainiA,FacchettiR,onshipbetweenvasculardamageandleftventricularconcentricgeometryinpatientsprospectivestudy[J].JHypertens,2019,37(6):oingcoronaryangiography:amulticenter[20]　KimNH,ShinMH,KweonSS,datherosclerosisandpopulation:thenamwonstudy[J].ChonnamMedJ,2017,53(2):onalchangesinpatientswithlivercirrhosisawaitingliverresonanceandechocardiographicstudy[J].JCardiovascMagnReson,2020,22(1):icelectrocardiographicleftventricularhypertrophyinthegeneral〔收稿日期〕2020-06-01