基因组测序成本下降非常快,可以用于个性化诊断,eg:肿瘤序列-靶向疗法
第一代测序:桑格测序 Sanger sequencing(需要扩增dna,并且每次只扩增一个分子,所以需要扩增很多次同一单链DNA的多个拷贝)
第二代测序:大规模平行测序 Illumina Sequencing Cluster Generation(不需要将不同DNA分装到不同的管子当中进行扩增,可以将很多很多个分子倒在流动池上进行原位扩增,边合成边测序)如果需要产生很多很多的片段,需要了解定量水平,第二代测序更符合要求。
第三代测序:真正的单分子测序,甚至再也不需要扩增dna。一般来讲,会使用聚合酶或微孔进行测序,然后根据acgt当中哪个核苷酸被结合或通过微孔而发出不同的信号。
学无止境!!!
高质量序列的碱基其实是高质量并连续出现的。
碱基对应质量值的分布
在全基因组水平进行测序,每一种类型的碱基其占比应在25%左右。
将实际的GC content与期望的GC content进行对比,右图意味着测序也许出现了问题。
局部比对是一种序列比对技术,在该技术中,我们对比两个序列之间具有较高相似性的区域,即具有最高匹配密度的序列的延伸,这适用于更多部分相似且在序列之间具有保守区域的转向序列。
smith waterman算法是最常见的局部比对,属于动态规划,讲一个问题分解为更小更简单的子问题。
全局比对试图将整个序列彼此比对,而局部比对仅比对这些具有最高相似性。全局比对比对来自查询序列和目标序列的所有字母,而局部比对将目标序列的子串与查询序列的子串对齐。
因此,全局比对更适合密切相关的序列,而局部对比更适合发散或远相关的序列。
序列最常见的全局比对算法是needleman-wunsch,而局部比对是smith-waterman。
三者都是衡量基因相对表达量
RPKM(Reads Per Kilobase per Million)
FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)
TPM:Transcripts Per Kilobase per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)
RPKM和FPKM的计算方法:第一步先将测序深度标准化,第二步是基因长度的标准化,即将第一步的read per million直接除以基因长度即可。
TPM的不同在于它的处理顺序是不同的。即先考虑基因长度,再考虑测序深度。
在芯片时代,RNA-Seq测序的reads分布,一般被认为是正态分布。
RNA-Seq测序得到的reads分布,一般符合泊松分布。
检测差异基因表达的方法是进行对每一个基因进行统计检验。
所谓的independent filtering,意思是在进行统计检验之前,筛掉那些不能或是很可能不能通过显著性检验的探针。independent filtering就是为了降低假设检验的假阴性。
与GO富集分析的差异在于GSEA分析不需要指定阈值(p值或FDR)来筛选差异基因。
heatmap(热力图),通过颜色的深浅程度来判断不同类别间的差异,呈现不同特征间的聚类关系,通常用做聚类分析(如层次聚类,kmeans聚类等)。
Hierarchical Clustering(层次聚类)
自上而下:分裂法,初始时将所有的样本归为一个类簇,然后依据某种准则进行逐渐的分裂,直到达到某种条件或者达到设定的分类数目。
自下而上:凝聚法,初始时将每个样本点当做一个类簇,所以原始类簇的大小等于样本点的个数,然后依据某种准则合并这些初始的类簇,直到达到某种条件或者达到设定的分类数目。
K-means Clustering(k均值聚类),基于样本集合划分的聚类算法。
Consensus Clustering(一致性聚类),被广泛用于基于亚群鉴定和癌症分型等研究方向,采用重抽样方法打乱原始数据集,对每一次聚类的样本进行聚类分析,最后再综合评估多次聚类分析的结果给出一致性。
本文发布于:2024-01-28 09:53:38,感谢您对本站的认可!
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