PROTAC体外泛素化检测试剂盒

PROTAC体外泛素化检测试剂盒

泛素为含76个氨基酸组成的高度保守的小分子蛋白质、大小约为8.6 kDa，在蛋白质降解和细胞信号传导中起着重要作用。泛素具有7个赖氨酸残基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)和一个甲硫氨酸残基(M1)，泛素之间主要通过赖氨酸残基和甲硫氨酸残基进行各种连接，由此产生的泛素链产生一定的拓扑结构,可通过对蛋白底物进行修饰并决定底物的功能。泛素可以通过其C-末端与靶蛋白上的赖氨酸残基的胺基团结合。这种结合被称为单一泛素化。额外的泛素基团可以通过泛素中的七个赖氨酸残基之一与初始泛素结合。这些泛素链的形成被称为多泛素化。其中最为研究的多泛素化形式是通过泛素的第48位赖氨酸（K48链）形成链。单一泛素化已被证明可以改变靶蛋白的定位、活性和/或功能。多泛素化常见的后果是通过蛋白酶体介导的靶蛋白降解。

将泛素连接到靶蛋白需要三种不同连接酶的协同作用，即E1（泛素活化酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶），从而在泛素的C-末端和靶蛋白上的赖氨酸残基的ε-氨基团之间形成异肽键。泛素E3连接酶充当骨架蛋白，为泛素结合酶（E2）和目标底物提供停靠位点。通常，E3连接酶介导将泛素从E2硫酯中间体转移至底物蛋白的酰胺连接（Hershko and Ciechanover, 1998）。除了对底物的泛素化，E3连接酶还可以对自身进行“自我泛素化”。  

LifeSensors的PROTAC体外泛素化检测试剂盒旨在通过监测蛋白质固有的泛素化能力，可以准确预测PROTAC的效率。  

艾美捷PROTAC体外泛素化检测试剂盒检测原理：

使用预涂有专有的TUBE试剂（检测板）的微孔板条，用于捕获PROTAC依赖反应中形成的多泛素链。在检测过程中，首先将PROTAC加入到检测板中，然后加入E3连接酶和待检测的目标蛋白，以形成三元复合物。接下来，将含有野生型泛素和ATP的E1-E2酶混合物加入到孔中，以启动PROTAC介导的泛素化反应。在反应过程中，E1-E2-E3机制生成的多泛素链被识别并捕获在孔中。在反应和随后的洗涤步骤后，将分离的多泛素化产物与目标蛋白的抗体（不包含在内）和与-HRP偶联的二抗（包含在内）一起孵育，以便通过化学发光进行检测。因此，在这种“三明治”ELISA样的检测方法中，捕获的多泛素化产物产生的信号是PROTAC活性的定量指标。

PROTAC体外泛素化检测试剂盒组分：

注意：将所有材料储存于-80?C，避免多次冻融循环。所有组分至少稳定保存2个月。

1：体外泛素化检测板：注意不要将检测板迅速解冻至室温。建议最初将检测板放置在4°C下30分钟，然后再转移到室温下。

2：10倍检测缓冲液：规格：1.2 mL，注意：在1倍检测缓冲液中新鲜添加β-巯基乙醇，最终浓度为1mM。

3：E3混合液（2倍浓度）：规格：1 x 250 ul（20倍浓度），注意：将选择的目标蛋白以40-80 nM的浓度加入提供的E3混合液中，以促进PROTAC和E3连接酶的三元复合物形成。

4：E1-E2-泛素混合液（2倍浓度）：规格：1 x 250 ul（20倍浓度）

5：二抗（抗小鼠或抗兔HRP偶联）：规格：60uL（100倍浓度）

6：检测试剂1和2：规格：1 mL的检测试剂1和1 mL的检测试剂2

7：阻断浓缩液（5倍浓度）：规格：5 mL

8：阳性对照试剂

DMSO中的PROTAC（50倍浓度）：10 uL（MZP54，dBET6，A1874）

目标蛋白阳性对照BRD3（20倍浓度）：20 uL

抗-BRD3抗体（100倍浓度）：5 uL

抗小鼠HRP偶联物（100倍浓度）：5 uL   

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