一种溶酶体靶向的原位自组装短肽设计及抗肿瘤活性研究

一种溶酶体靶向的原位自组装短肽设计及抗肿瘤活性研究

摘要:肿瘤已成为威胁人类生命的一大杀手，目前主要采用手术和放、化疗等手段进行治疗，但由于放、化疗的细胞选择性差、毒副作用明显且易引起肿瘤细胞产生耐受（/药）性，不利于肿瘤的持续治疗，因此亟待研发具有定向定位优势、毒副作用低的新型靶向药物. 原位自组装多肽能识别肿瘤部位的特异性高表达物质，在肿瘤部位靶向性聚集形成稳定的纳米结构，实现精准和高效治疗，有望成为一种新型的抗肿瘤药物. 本研究基于多肽原位自组装的设计理念，利用溶酶体内组织蛋白酶L的催化活性，设计了靶向溶酶体且能够原位自组装的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，研究了该分子的自组装特性及抗肿瘤活性. 结果显示，在体外酸性条件下，组织蛋白酶L能精准切割Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子，其酶切产物Fmoc-FFR-OH自组装形成长纳米纤维结构，对肿瘤细胞A375和SH-SY5Y均具有较好的杀伤作用. 该分子通过靶向溶酶体杀伤肿瘤细胞且对正常细胞的毒性较低，有望成为一种新型的抗肿瘤药物.
肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，已严重威胁人类健康［1］. 目前肿瘤治疗主要使用手术和放、化疗，但放、化疗通常毒副作用明显、细胞选择性差且易导致肿瘤细胞产生耐受（/药）性，不利于肿瘤的持续治疗. 因此亟待研发具有靶向性且毒副作用小的新型抗肿瘤药物. 抗肿瘤多肽因其活性高、毒性低且不易引起细胞产生非特异性免疫反应等优点，展现出良好的应用前景. 然而，普通抗肿瘤多肽存在生物体内的作用机制不明确、稳定性差等问题，性能还需进一步提升.
多肽自组装是多肽分子自发聚集形成有序结构（如纳米球、纳米管、纳米棒等）的过程，通过该过程，一方面可以提升多肽分子的稳定性；另一方面，可赋予其特殊的生物学功能，如药物控释、细胞培养、组织工程支架等［2］. 一些具有特定形貌的多肽自组装结构也表现出优良的抗肿瘤活性［3-6］，如Chen等［4］发现，CL-1多肽在组装后对含有磷酯酰丝氨酸的磷脂膜具有较大的破坏作用，具有较好的抗肿瘤活性. KLVFF-交联的透明质酸纳米纤维，表现出较好的抗胸腺癌细胞的发展和转移性能［3］. 前期研究中，我们也发现短肽分子A9K形成的纳米短棒能破坏肿瘤细胞的细胞膜，快速杀死肿瘤细胞［5-6］. 多肽分子的组装过程主要依赖于分子内/间各基团的静电吸引、疏水作用、氢键以及范德华力等非共价作用力共同驱动，组装过程容易受到外界环境（如pH、温度、光照、离子强度等）的影响，从而导致组装体微观形貌或材料宏观性质发生改变. 基于此，科学家提出了“肽原位自组装”的概念，即具有靶向性的前体肽分子在体内特定靶点部位高效聚集，并在该部位特异性高表达的物质诱导下，自组装形成特定形貌的组装体结构［7-8］，从而行使特殊的生物学功能. 在不同肿瘤组织中，碱性磷酸酶、酪氨酸酶、基质金属蛋白酶等生物酶的表达量增加，特定序列的多肽分子可在上述酶的催化作用下组装形成特定形貌的纳米结构，杀死肿瘤细胞［9-13］，在肿瘤的精准定位和靶向治疗方面展现出广阔的应用前景.
溶酶体在分子伴侣热休克蛋白70（heat shock cognate protein，HSC70）的参与下调控细胞内自噬，在肿瘤的发生和发展过程中扮演重要角色［14-15］. HSC70可识别含有KFERQ序列的蛋白质和多肽底物，并与溶酶体膜上的受体结合，介导底物进入溶酶体进行降解［16］. 溶酶体中含有多种水解酶，其中组织蛋白酶L（cathepsin L）是一种普遍表达的半胱氨酸蛋白酶，在降解多种生理蛋白底物方面具有较高的特异性［17］，能调控肿瘤细胞的生长［18］. 根据Schechter—Berger命名法，将酶切位点定义为P位点，其酶切序列为...P3-P2-P1-P1′-P2′-P3′...［19］，当水解蛋白质分子时，底物序列中的P2位点决定了cathepsin L的酶切特异性，一般其P2位为含有苯环的氨基酸时，cathepsin L的酶切效率较高［20］；同时当P1位点为精氨酸（arginine，R），P2和P3位点为疏水性氨基酸残基时，其酶切效率也能大大提升［21］. 通过溶酶体内组织蛋白酶水解产生的氨基酸残基可被肿瘤细胞利用，进行快速分裂增殖，因此可通过控制溶酶体的活性来达到抗肿瘤的目的［22］.
本研究利用肿瘤细胞内溶酶体数量较多的微环境，基于多肽原位自组装的设计理念，将溶酶体靶向序列与自组装超短肽序列结合，设计了包含cathepsin L酶切位点的短肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，目的是使该分子既能靶向溶酶体，又能利用溶酶体内cathepsin L的催化作用原位组装形成新的组装体结构，选择性杀伤肿瘤细胞. 通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight ma