艾滋病检测技术HIV-1核酸检测规范

2024年2月6日发(作者：)

艾滋病检测技术HIV-1核酸检测规范

1 范围

本章规定了HIV-1核酸定性和定量检测（病毒载量）的意义、实验室要求、检测方法、质量控制及结果判定标准，适用于HIV-1核酸的定性检测和定量的测定。

2 核酸检测的意义

核酸检测可用于HIV感染诊断、血液筛查、病程评估及抗病毒治疗效果监测。

2.1 感染诊断

2.1.1 作为补充试验：用于筛查试验有反应但抗体确证试验不确定或阴性样本的判定；对筛查试验有反应但抗体确证试验不确定或阴性的疑似艾滋病晚期患者需将核酸检测、临床病史和CD4+T淋巴细胞计数检测结果综合判断。对于抗体筛查试验阴性但免疫功能低下者，也可进行核酸检测，结合临床综合判断。

2.1.2 急性期诊断：对近期有明确流行病学史的个体，包括患有性病或有性病史，有同性和异性性接触不安全性行为，有共用注射器吸毒史，有医源性暴露史，有职业暴露史，HIV/AIDS 患者的配偶或性伴侣，HIV/AIDS 母亲所生子女等，如抗体筛查试验无反应，可通过核酸检测判定是否为急性期感染。核酸检测结果阴性或低于最低检测限不能排除HIV-1感染。

2.1.3 HIV-1暴露婴儿感染早期诊断

HIV-1感染母亲所生小于18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV-1核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同。

2.2 血液筛查：对献血者及采供血机构的原料血浆进行核酸检测，可及时发现窗口期感染，降低输血的“残余危险度”，减少二代传播。

2.3 抗病毒治疗效果监测

HIV感染者和艾滋病病人经抗病毒药物治疗后，定期进行HIV-1病毒载量检测，可判断抗病毒药物治疗的疗效。病毒载量结果动态分析，对决定是否继续使用原定的治疗方案以及是否需要更改治疗方案起到重要作用。一般启动抗病毒治疗6个月后应进行病毒载量检测，以监测治疗效果，每年应检测一次。治疗前进行检测可了解病人的病毒载量基线，有助于评价治疗后效果。如适时重复检测病毒载量，没有低于检测限，需要考虑治疗是否失败。此外，HIV-1DNA定量检测可判定HIV储存库含量，可更准确预测HIV传播风险和病程进展。HIV-1 DNA定量高者，传播风险的可能性高，病程进展快而严重，DNA定量测定为进一步疗效评价提供新的技术手段。

3 HIV核酸检测实验室要求

HIV核酸检测应在符合要求的实验室中进行，应制定严格的管理制度和建立与实验和实验室管理相关的标准操作程序。实验人员必须充分了解并严格遵守各项规定和掌握操作技能，并严格遵照执行。核酸定性、定量检测要严格满足分子生物学实验室的要求。

3.1 实验室的设计及工作基本原则

HIV核酸检测实验室设计及实验室的基本工作原则应符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》附件中“医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则”和《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南》的要求。

3.2 实验室人员和要求

进行HIV核酸检测的人员需具有艾滋病核酸检测的上岗资格，接受过市级以上的实验操作技术培训及相关技术设备及检测产品提供商的培训，并接受过实验室生物安全培训。

3.3 实验室生物安全

实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

4 HIV-1核酸检测方法及程序

HIV核酸检测分为定性和定量试验。HIV核酸定性检测主要采用实时荧光定量PCR方法，HIV核酸定量检测主要基于靶核酸扩增和信号放大两种方法。定性和定量检测均可用作HIV感染诊断，定量检测还可用于抗病毒治疗效果监测。

4.1 HIV-1核酸定性检测

4.1.1 方法：HIV-1核酸定性检测包括RNA检测和DNA检测。RNA检测主要是检测血浆或血清中的RNA，DNA检测主要是检测全血、干血斑或组织细胞中的前病毒DNA或总核酸。二者相比，HIV-1DNA检测的稳定性更好。

目前，HIV核酸定性检测主要有实时荧光定量PCR方法、荧光探针PCR法及以焦磷酸化激活聚合酶（PAP）反应为基础的核酸扩增PCR方法。

4.1.2 试剂：必须是经国家药品监督管理局注册、在有效期内的试剂。严格按产品说明书操作。

4.1.3 结果判定与报告：检测结果显示“有反应”或“检测到”，报告本次核酸阳性；检测结果显示“无反应”或“未检测到”，报告本次核酸阴性。核酸定性检测阴性不能排除HIV-1感染，特别是对有高危行为、暴露前或暴露后预防用药的个体，需要根据流行病学史、临床表现和实验室其他相关指标进行诊断。

4.2 HIV-1核酸定量检测

4.2.1 方法

4.2.1.1 RNA检测

主要是定量检测血浆中的病毒RNA，检测的主要原理是实时荧光定量PCR（Real Time-PCR）。主要步骤包括提取、纯化血浆中的病毒RNA，逆转录，进行PCR扩增，通过实时荧光定量PCR检测得到结果。

由于HIV-1高度变异，影响HIV-1RNA定量检测的敏感性，且同一样本由于不同试剂的方法学差异（例如，不同的试剂盒之间的扩增片段或荧光探针的差异），可能出现不同的结果，因此应选择能够检测出当地主要HIV-1流行毒株的试剂。评估抗病毒治疗效果和病程进展，对同一病人最好始终使用同一种试剂，有助于合理解读病毒载量的变化。要考虑检测试剂版本的更新情况。不同试剂间的检测结果无固定的转换关系。

4.2.1.2 DNA检测

包括全血、干血斑、PBMC及组织中DNA检测。血液中总HIV-1DNA含量测定是目前最常用的方法。同定性检测一样，总HIV-1DNA含量测定主要有荧光探针PCR法及以焦磷酸化激活聚合酶（PAP）反应为基础的核酸扩增PCR方法。针对整合的HIV-1DNA的检测方法主要有Alu-gag PCR法，但由于灵敏度低等缺点未在临床上广泛应用。

4.2.2 试剂

必须是经国家药品监督管理局注册、在有效期内的试剂。严格按说明书操作。

4.2.3 结果判定与报告

按照试剂盒说明书判定检测结果：

4.2.3.1 用于HIV-1感染的诊断：检测值>5000 CPs/ml(或IUs/ml)，报告检测值；检测值≤5000 CPs/ml(或IUs/ml)，需严格按核酸检测的要求，再次采样检测后报告检测值。结果>5000 CPs/ml(或IUs/ml)可以作为诊断依据；结果仍为≤5000 CPs/ml，则需结合流行病学史、临床病史、CD4+T淋巴细胞计数和HIV-1抗体随访检测结果等进行综合判断。检测值小于检测下线，报告低于检测限。对于暴露前或暴露后预防用药的个体，检测值低于最低检测限不能排除HIV-1感染，需要根据流行病学史、临床表现和实验室其他相关指标进行综合判断。

4.2.3.2 用于治疗效果监测：检测值小于试剂盒检测范围下限，报告低于检测限；检测值大于等于试剂盒检测范围下限，报告检测值。

4.2.3.3 HIV-1DNA定量检测结果的判定，按照试剂盒说明书，检测报告根据临床应用情况决定。

4.3 集合核酸定性检测（Pooling PCR）

利用核酸检测方法的高度敏感性的优势，对HIV抗体检测阴性的高危人群的样本进行集合核酸检测，可及时发现窗口期HIV-1感染者。

4.3.1 样本集合程序

4.3.1.1 根据预处理样本量，计算预形成一级和二级集合数量，在登记表格上记录一级和二级集合及对应的原始样本编号。

4.3.1.2 吸取130L样本，移入标记二级集合的离心管中；10份样本形成一个1300L的二级集合样本，充分涡旋震荡混匀。

4.3.1.3 从5个二级集合管中分别吸取210L样本，移入标记有一级集合的离心管中，形成由50份样本组成的体积为1050L的一级集合样本，充分涡旋震荡混匀。

4.3.1.4 从每个一、二级集合管中吸取1000L集合样本，分装至另一相应标记的离心管，用超敏感核酸检测试剂进行检测。

4.3.1.5 制备阴性集合外部质控品：使用50份HIV抗体和核酸阴性样本，按上述步骤，分别集合成5个阴性二级集合外部质控品和1个一级集合外部质控品。

4.3.1.6 制备阳性集合外部质控品：从9份HIV抗体且核酸阴性样本和1份至少含有浓度为 104CPs/ml HIV-1RNA的阳性样本中，分别移取130L加入离心管

中，形成一个1300L的阳性二级集合外部质控品。再分别从4个已制备好的阴性二级集合外部质控品和上述阳性二级集合外部质控品中，移取210L至标记为一级阳性集合外部质控品的离心管中，形成一级阳性集合外部质控品。

4.3.1.7 一级和二级阴、阳性集合外部质控品分别用于RT-PCR中每一轮一级和二级集合样本的检测。

4.3.2 集合样本的检测和分解路线

使用商品化核酸检测试剂，应严格按照试剂说明书操作。按照各商品化核酸试剂集合PCR的方案进行检测，集合样本的数量根据各试剂方案操作。

4.3.2.1 用HIV-1病毒载量检测方法对一级集合样本进行检测，阳性反应的一级集合样本进入下一检测步骤。阴性则不进行分解。

4.3.2.2 用HIV-1病毒载量方法对所有组成阳性一级集合的二级集合样本进行检测，阳性反应的二级集合样本进入下一检测步骤。

4.3.2.3 用HIV-1病毒载量方法检测所有组成阳性二级集合样本的10份单个样本，确定核酸阳性的单个样本。

4.3.3 适用范围

血液筛查和各类高危人群样本检测，通常是抗体筛查阴性的样本。要求样本采集、分离、保存均应满足核酸检测的要求。

4.4 HIV-1核酸即时检测(molecular point-of-care Testing, POCT)

HIV核酸即时检测是在床旁、现场或者急诊进行的，能快速获得检测结果的一类检测方法。POCT检测适用范围广泛，且可避免样本长途运输导致的质量

下降，非专业人员经培训后也可操作。可用于HIV-1感染、儿童早期HIV感染的辅助诊断、病程监控及抗病毒治疗效果评价。

5 质量保证和质量控制

质量控制包括从样本接收到发出报告各环节的管理过程，包括：（1）人员；（2）实验室分区和环境；（3）仪器；（4）检测过程（试剂、操作过程，外部质控品使用等）。

所有相关检验人员需经过理论及实践培训，能独立熟练地操作，考核合格，持证上岗。

5.1 实验室分区和环境

HIV-1核酸检测实验室原则上应至少分为三个独立的工作区：试剂准备区、样本处理区、扩增产物分析区，并设在不同房间。严格要求三区的空气流向：从试剂准备区到样本处理区，然后到扩增产物分析区，不能逆向流动。

5.2 仪器设备质量控制

加样器、温湿度计需经计量部门校准，每年一次；要定期对HIV-1病毒载量检测仪、实时荧光PCR仪等仪器进行维护保养。冰箱、水浴箱用校准合格的温度计监测温度，并做好记录。

5.3 检测过程质量控制

用于HIV感染辅助诊断的试剂，要保证所有试剂盒有效并经国家药品监督管理局注册，实验中使用无DNA和RNA酶的水；严格执行仪器和试剂的标准操作程序（SOP），不得擅自修改。HIV-1核酸定性检测每次实验建议加阳性对照、阴性对照和试剂对照。定量检测建议使用一个HIV-1 RNA为5000～

15000CPs/ml的外部质控品；每次实验按照试剂盒说明书的要求使用试剂盒提供的外部质控品，并满足外部质控品的要求。