试剂盒提DNA步骤

2024年10月2日发(作者：)

OMEGA--D5525-01型水样中DNA提取试剂盒

E．Z．N．AWaterDNA Kit

TM

D5525-01试剂盒内含：

Hinbind DNA结合柱50个，2mL收集管100个，玻璃珠27g，HTR试剂10mL，BufferSLX

180mL，SP2 Buffer 60mL,XP1 Buffer40mL,Elution Buffer 30mL,DNA Wash Buffer 20mL。

有关Buffer GPS

硅胶柱（即Hinbind DNA结合柱）经Buffer GPS预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎

水基团，提高核酸的结合能力。柱子在长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而

影响其核酸的结合能力。Buffer GPS是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。

用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存Buffer GPS。在保存过程中可能会有沉淀生成，

请加热至37℃使沉淀完全消失。

需要准备的：

预定工作台(9：00—16:00)超净台在开紫外前先用75%的酒精棉擦拭以使台面尽量无菌，

预定4℃离心机(10:00-（至少定3h），采水样，清洗抽滤装置（擦洗灭菌），（95%乙醇泡烧）

无菌镊子、剪刀，水浴锅（先设定为70℃，冰盒（70℃水浴时制即可）、试剂盒，异丙醇，

无菌锡箔纸、吸水纸、1000μL移液器及枪头，黄枪头，计时器，灭菌勺，离心管架，转速

约14000g的离心机，灭菌50mL离心管，灭菌1.5mL离心管， ddH2O，0.22μm微孔滤膜，

75%酒精及灭菌脱脂棉（用来擦洗已提过水样的漏斗），放镊子剪刀大离心管等的试剂架。

Buffer GPS对硅胶柱的前处理：（在超净台中操作，可以在第10步时处理柱子）

1. 取一个新的Hinbind DNA结合柱装在收集管中，吸取合适体积的Buffer GPS平衡缓冲液

（小柱提取用200μL，中柱提取用1mL，大量提取用3mL）至柱子中。室温放置3~5min。

2. 室温下，12000g，离心2min。

3. 倒弃收集管中的滤液，把Hinbind DNA柱子重新装在收集管中；加入700μLddH2O至柱

子中。

4. 室温下，12000g，离心2min。

5. 倒弃收集管中的滤液，把Hinbind DNA柱子重新装在收集管中。这就是平衡好的柱子。

注意：该流程处理好的柱子可室温放置1~2周。

DNA提取：（试剂盒内试剂的打开需要在超净台上）

1. 事先用80mL无水乙醇将DNA Wash Buffer稀释后室温保存。

2. 在超净工作台中，将无菌滤膜打开，一手用灭菌的镊子夹住另一只手用剪刀沿滤膜滤膜

外缘约减去1cm的圆环（以能盖住漏斗的孔径为宜），放入抽滤装置的无菌漏斗中。用

0.22μm微孔滤膜过滤水样。（所用水样体积取决于所采集水样的浑浊度，对于浑浊度高

的水样建议先用较大孔径的滤膜过滤以防阻塞微孔。）海水样提取时,需要保存的样品,

有菌面对折后用无菌锡箔纸包住，装于一灭菌袋中，标记好后放于-60℃保存。

3. 用镊子将滤膜从漏斗中取出、折叠，用剪刀将其剪碎入一个50mL的无菌离心管中。

4. 向离心管中加3mLSLX Buffer和500mg玻璃珠（约3小勺）。

5. 最大转速涡旋震荡3min左右，使样品与溶液彻底混匀，使膜上菌体进入溶液。

6. 70℃或90℃水浴10min使菌体裂解涡旋震荡2~3次。（制冰盒）

7. 向管中加1mLSP2 Buffer涡旋震荡30s。冰浴5min。

8. 4℃,4000g离心10min。（配平）

9. 在超净台中将上清转移至一新的15mL或50mL管中，加0.7倍体积的异丙醇。翻转混匀

30~50次，在-20℃下至少放置30min。期间翻转几次。（将水浴锅调至65℃）

10. 4℃,10000g离心20min使DNA沉降。

11. 将离心管平放，使以沉降的DNA贴于壁上在室外将液相倒掉后将管倒扣在吸水纸上沥

干，若还有残留，则在超净台中用移液器吸去。

12. 向管中有DNA沉降处加400μL Elution Buffer，吸打混匀，是DNA溶解后将其转入1.5mL

无菌离心管中，涡旋震荡彻底混匀20s。在65℃水浴10~30min以溶解DNA。（如果想得

到不含RNA的DNA，在这一步向样品中加10μLRNA酶A（25mg/mL）。

13. 向1.5mL离心管中，加100μL HTR Reagent（试剂）。旋转震荡混合10s后室温放置2min。

（注意：用HTR Reagent（试剂）前要用涡旋仪将其彻底震荡混匀。）

14. 12000rpmin高速离心3min使HTR Reagent沉降。（若转速达不到可以降低转速增加离

心时间。注意：若经HTR Reagent提取后样品仍然显棕色或深色，则用HTR Reagent重

复13~14步提取。）

15. 将上清（通常约400μL）转移至一新的1.5mL离心管中，加入等体积的XP1 Buffer。通

过旋转震荡充分混匀。

16. 将处理的DNA吸附柱放入一个2mL的收集管中（试剂盒中提供，该步已作）。

17. 将样品全部转入该DNA吸附柱中，室温下，10000rpmin离心1min。将离下的液相倒掉，

重新将吸附柱放回收集管中。（该步重复）。

18. 向吸附柱中加300μL XP1 Buffer，室温下，10000rpmin离心1min。弃去收集管和其中的

液相。

19. 将吸附柱放入一个新的2mL收集管中，加750μL DNA Wash Buffer（用无水乙醇稀释），

10000rpmin离心30s 。弃去液相，将吸附柱重新放回收集管中。

20. 最大转速空离2~3min，使吸附柱干燥。（空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步对

去除乙醇残余至关重要，乙醇残留可能会影响下游酶的使用。）

21. 将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，将50~100μL DNA Elution Buffer垂直悬空加至

吸附柱中央，65℃水浴3min。最大转速离心1min洗提回收DNA。（枪头不要碰触吸附

柱，先加50μL Elution Buffer水浴离心完后换个1.5mL离心管，再加30μL Elution Buffer，

水浴离心，将两次得到的DNA溶液合并后再分装，一个30μL、一个50μL，前者放4℃

常用，后者-20℃低温储存）。

22. 得到的DNA洗提样品-20℃保存。

注意事项：

1. 剪刀、镊子提前烧好冷却灭菌。

2. 抽滤时，将滤膜放于漏斗中后先加入少许水样将滤膜润湿，打开抽滤泵使滤膜紧紧吸附

于漏斗底部，然后再将水样缓缓倒入。这样可以避免滤膜漂浮起来。

3. 水浴锅先开70℃