NLRP3过表达对非小细胞肺癌不同细胞系生物学行为的影响

2024年2月3日发(作者：)

476Labeled

Immunoassays

&

Clin

Med,

Mar.2021, Vol.28

,

No.3•基础研究•NLRP3过表达对非小细胞肺癌不同

细胞系生物学行为的影响杜卫华王昌媛3,信芳杰4,宋

文5,杨镇翠2,赵

鹏4,宗金宝6（1青岛大学医学部，山东青岛266101；.青岛大学附属医院检验科，山东青岛266500；3.青岛市市立医院皮肤科，山东青岛266011；.青岛大学附属医院病理科，山东青岛266500；5.青岛大学附属医院消化内镜中心，山东青岛266071

；6.青岛市中医医院和青岛大学附属青岛市海慈医院检验科，山东青岛266034）摘要：目的探讨慢病毒介导的NLRP3过表达对非小细胞肺癌（NSCIC）

A549细胞和NC-H460细胞的增殖、迁移、侵

袭和凋亡的影响，并比较两种细胞系生物学行为的差异，探索NLRP3成为药物开发新靶点或潜在调节因子的可能性.

方法

设计并构建NLRP3过表达慢病毒载体，用过表达慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体分别感染人NSCLC

A549和

NC-H460细胞，获得NLRP3过表达细胞组（O/E组）和阴性对照细胞组（CON组）.采用CCK-8法、细胞划痕实验、

Transwcll侵袭实验、流式细胞技术分别检测两组细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡的情况.结果

NLRP3过表达对A549

细胞的增殖起促进作用，抑制NC-H460细胞的增殖，其过表达促进A549细胞的迁移和侵袭，抑制A549细胞的早期凋

亡.NLRP3过表达对NC-H460细胞的迁移、侵袭、凋亡均无明显影响.结论

NLRP3过表达促进A549细胞的增殖、

迁移和侵袭，抑制早期凋亡，其过表达对NC-H460细胞的增殖有抑制作用.由此可以推断NLRP3可能成为NSCLC治

疗药物开发的新靶标或潜在调节因子.关键词:NLRP3；过表达；非小细胞肺癌；增殖；迁移；侵袭；凋亡中图分类号:R734.2

文献标识码:AEffects

of

Overexpression

of

NLRP3

on

Biological

Behavior

of

Different

CelLinesofNon-smalCelLungCancerDU

Weihua1,

WANG

Changyuan3,

XIN

Fangjie4

,SONG

Wen5,

YANG

Zhencui2,

ZHAO

Peng4

,ZONG

Jinbao6（1.

Medical

Department

of Qingdao University,

Qingdao

266101,

China；，2 .

Department

of

Clinical

Laboratory,

the

Affiliated

Hospital

of Qingdao

University,

Qingdao

266500,

China；3.

Department

of

Dermatology,

Qingdao

Municipal

Hospital,

Qingdao

266011,

China；4.

Department

of

Pathology,

the

Affiliated

Hospital

of

Qingdao

University,

Qingdao

266500,

China；5.

Digestive Endoscopy

Center,

the

Affiliated

Hospital

of Qingdao

University,

Qingdao

266071,

China；6.

Department

of

Clinical

Laboratory,

Qingdao

Hospital

of

Traditional

Chinese

Medicine

and

the

Affiliated

QingdaoHiser

Hospital

of Qingdao University,

Qingdao

266034,

China）Abstract：Objective

To

explorethe

effectoflentivirus-mediated

overexpression

of

NLRP3

onthe

proliferation,

migration,

invasionandapoptosisofnon-smalcellungcancer

（NSCLC）

A

49

and

NCI-H460

cell

lines,

and

to

compare

the

biological

behavior

of

the

two

cell

lines,

so

to

address

the

posibilityofNLRP3asanewtargetorpotentialregulatorforthedrugdevelopment Methods

NLRP3DOI： 10.11748//.l006-1703.2021.03.024收稿日期:2020-11-30；修回日期:2021-02-20基金项目：中国博士后科学基金第60批面上项目（编号:2016M600523.）；青岛市博士后应用研究项目（编号=2016050.）

作者简介：杜卫华（

1990—）,硕士

.研究方向：肿瘤免疫学.通讯作者：宗金宝（

1978—）,博士，硕士生导师，主任技师.检验科及中心实验室负责人.研究方向：肿瘤免疫学.

标记免疫分析与临床

2021年3月第28卷第3期477overexpresionlentivirusvectorwasdesignedandconstructed

Human

NSCLC

A

49

and

NCI-H460

cellineswereinfectedwithoverexpressionlentivirusvectorornegativecontrollentivirusvector,and

NLRP3

overexpresioncelsandnegativecontrolcelswereobtainedrespectively

Theproliferation,

migration,

invasion

and

apoptosis

of

the

two

groups

were

detected

by

CCK-8

method,

cell

scratch

test,

Transwelinvasiontestandflowcytometry

Resuts

TheoverexpresionofNLRP3couldpromote

the

proliferation

of

A549

cells,

inhibit

the

proliferation

of

NCI-H460

cells,

enhance

the

migration

and

invasion

of

A549

cells,

and

inhibit

the

early

apoptosis

of

A549

cells.

The

overexpression

of

NLRP3

had

no

significant

effect

on

the migration,invasion

and

apoptosis

of

NCI-H460

cels.

Conclusion

Overexpression

of

NLRP3

can

enhance

the

proliferation,

migration

and

invasion

of

A549

celsandinhbtstheearlyapoptoss,

whleitcanalsoinhbttheprolferatonof

NCI-H460

cels.

Therefore,

NLRP3

may

serve

as

a

new

target

for

the

development

of

NSCLC

therapeut

c

drugs

or

words:NLRP3；

Overexpression；

NSCLC；

Proliferation；

Migration；

Invasion；

Apoptosis肺癌是世界范围内最常见且死亡率最高的癌

症[1].非小细胞肺癌(non-small

cell

lung

cancer,

蛋白(ASC)和效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1

(Caspase-1

)组成的大分子多蛋白复合体⑺。

NLRP3炎性小体一旦被激活便触发前Caspase-1蛋

白水解为有活性的Caspase-1(pl0或p20),活性形

式的Caspase-1将切割前IL-邛和前II-18使其形

NSCLC)占肺癌种类的大多数，主要包括肺腺癌、

肺鳞癌和大细胞肺癌.肺癌的传统治疗方案主要

有手术、放疗和/或化疗，但其不良反应不可小视.

近年来肺癌的分子靶向治疗及免疫治疗取得了极

成成熟的促炎细胞因子II-邛和II-18,从而对细胞

大进展并不断应用于临床，有效提高了肺癌患者的

生存率和生活质量，而患者确诊后5年生存率仍低

凋亡起诱导作用8.值的关注的是，某些研究报道NLRP3可独立于

于17%⑵.肺癌具有转移早、预后差的特征，患者

炎症小体途径而发挥作用9.如NLRP3的过表达

和组成性激活参与晚期黑色素瘤的进展[10].另有

被确诊时大多已到了晚期，失去了最佳治疗时机.

因此探索新的治疗靶点用以肺癌的有效治疗至关

重要.研究皈表明，下调NLRP3表达，抑制Caspase-1的

活性、阻断II-邛和/或II-18信号转导通路等不同

有研究发现，炎症在肿瘤的发生、发展中起到重

途径使NLRP3炎症小体的激活受到抑制，可减弱肺

癌A549细胞的增殖和迁移能力.然而,NLRP3过

要的作用.炎性小体作为天然免疫诱导的机体防御

炎症的一员，在癌症中的双重作用即促进或抑制癌

症的进展越来越得到认可⑷.炎性小体是通过各种

表达对肺癌发生发展的影响尚不清楚.在文献综述

的基础上，本实验构建了

NSCLC

A549、NCI-H460

细胞的NLRP3过表达模型，旨在探讨NLRP3过表

达对NSCLC

A549、NCI-H460细胞的增殖、迁移、

侵袭和凋亡的影响，为开发新的肺癌治疗药物靶标

病原微生物感染和/或机体的生理性应激而激活的

高分子量蛋白质复合物⑷.NLRP3炎性小体与其

他炎性小体不同的是多种刺激物可将其激活，如细

胞内K+外流、细胞内Ca2+浓度的改变、细菌或病毒

的感染、溶酶体损伤、活性氧形式等.NLRP3炎

或潜在调节因子提供理论依据.性小体与多

种

疾

病的

发

展

高

度

相

关：

多种

癌

症

如

肺

材料和方法1细胞及病毒载体的获取人肺泡上皮腺癌细胞系和大细胞肺癌细胞系

癌、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤等⑹.

炎症性疾病如类风湿性关节炎、炎症性肠道疾病；代

谢性疾病如2型糖尿病;神经系统疾病如帕金森病、

(A549、NCI-H460)均购自中国科学院细胞库(中

国，上海).NLRP3过表达慢病毒载体(pLent-

阿尔茨海默病；心血管疾病如缺血及非缺血性心脏

病等[6].因此，NLRP3炎性小体是目前最为关注的

CMV-

NLRP3-

3FLAG-

PGK

-Puro)及阴性对照慢

病毒载体(pLent-CMV-3FLAG-PGK-Puro)购自

炎性小体,由核苷酸结合寡聚化结构域样受体

(NLR)家族成员NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样

和元生物技术(上海)股份有限公司.

478Labeled

Immunoassays

&

Clin

Med,

Mar.2021, Vol.28,No.32

实验方法层，用无菌2000.移液管尖端划线，确保划线处无细

胞残留，分别在0、6、24

h于倒置显微镜(DMi8,

2.1

细胞培养

A549、NCIH460细胞分别用

含10%胎牛血清(FBS)的F12K培养基(Gibco)和

RPMI-1640

培养基(Gibco),置于

37°C,C()2

浓度为

Leica)下拍照。实验重复3次。细胞迁移率(％)

=

(初始划痕宽度值-xh后划痕宽度值)/初始划痕宽

度值x

100%。5%的培养箱中培养。2.2

慢病毒感染A549、NCIH460细胞两种

细胞均以浓度为5X104个/孔接种到24孔板中。用

2.6

细胞侵袭实验

T

ranswelKCorning)侵袭

实验检测细胞的侵袭能力。取2.5

x

104个A549

O/E

Lipofectamine

3000

(Invitrogen,

Thermo

Fisher

Scientific,Inc.2按照制造商说明将NLRP3过表达慢

组和CON组细胞分别悬浮于200“L无血清F-12K

培养基(Gibco)中，取

5

x

104

个

NCIH460

O/E

组

病毒载体(pLent.i-

CMV-

NLRP3-

3FLAG-

PGK

-

Puro)及阴性对照慢病毒载体(pLenti-CMV-

3FLAG-PGK-Puro)分别感染

A549

和

NCIH460

细胞。每孔加人反转录病毒介导的基因转导增强剂

聚凝胺(1

mg/mL)以提高感染效率。2.3

Western

blot.检测慢病毒在

A549、NCI

H460细胞中的表达情况

用RIPA裂解液和蛋白

酶抑制剂(Beyotime

Institute

of

Biotechnology)分

别从两种细胞的O/E组提取总蛋白。BCA蛋白浓

度测定试剂盒(Beyotime

Institute

of

Biotechnology)测定总蛋白浓度。取等量的两种蛋

白质(20

”g)在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝

胶(SDS-PAGE)电泳，然后转移至PVDF膜上。在

室温条件下用5%脱脂牛奶孵育1

h,用FLAG

(Sigma-Aldrich)、GAPDH

(

Bioworld

Technology,

Inc.)的特异性抗体检测蛋白质，4C孵育过夜。用辣

根过氧化物酶(HRP

)标记的二抗(Beyotime

Institute

of

Biotechnology)室温孵育

1

h。ECL

发

光液(Thermo

Fisher

Scientific,

Inc.2

检测

HRP

在

免疫印迹上的表达，显影仪(AlphaView,

SA)显影。2.4

细胞增殖实验用细胞计数试剂盒8

(Obio

Technology,

Shanghai,

China)检测细胞增殖

情况。将A549、NCIH460的O/E组和CON组细

胞分别以2X103个/孔接种于96孔板中，每个样品

设6个复孔。分别在0、24、48、72、96

h加10“L

CCK-8试剂于孔中,37C,5%

CO培养箱中培养

2h,酶标仪(Spark

10M,

TECAN)检测

450

nm

处

OD

值。2.5

细胞迁移分析采用划痕实验检测细胞

迁移情况。将A549、NCIH460的O/E组和CON

组细胞分别铺于6孔板中，待细胞完全融合形成单

和CON组细胞分别悬浮于200“L无血清RPMI-

1640

培养基(Gibco)中，分别接种于上室，两种类型

的细胞下室分别加入500“L含10%胎牛血清(FBS)

的F-12K培养基(Gibco)和RPMI-1640培养基

(Gibco)。培养24

h后取出小室，用4%多聚甲醛

(Solarbi。)固定下室中的细胞，结晶紫染液

(Beyotime)染色，计数侵袭细胞数，显微镜下拍照。

实验重复3

次。2.7

细胞凋亡检测流式细胞技术定量检测

细胞凋亡情况。扌巴A549、NCIH460的O/E组和

CON组分别用不含EDTA的胰酶消化制成单细胞

悬液，离心后收集细胞。结合缓冲液悬浮细胞，用

Annexin

V-

APC/7-

AAD(Keygen

Biotech)染色，同

时以单独染Annexin

V-APC和7-AAD的各组细胞

作为对照，室温、避光反应15

min,1

h内用流式细胞

仪(FACSCalibur,BD)进行检测,FlowJo

软件

10.6

(FlowJo

LLC)软件分析结果。实验重复3次。3

统计学处理采用

SPSS

19.0

和

GraphPad

Prism

5.01

软件

进行统计学分析，计量资料以均数士标准差表示,

Shapiro-Wilk法进行正态性检验,Levene法进行方

差齐性检验，两组之间的比较采用t检验，以P<

0.05为差异有统计学意义。结

果1

NLRP3

在

A549、NCI- H460

细胞

中均过

表达Western

blot.检测

NLRP3-F1AG

在

A549、NCI

H460细胞中的表达。如图1A和1B所示，两种细胞

的NLRP3

O/E组FLAG表达量均明显高于CON组

(P<0.01),说明

NLRP3

在

A549、NCIH460

细胞中

过表达成功。

标记免疫分析与临床

2021年3月第28卷第3期OVH」

JOIQA-UOISSaldxQ4791.00.8A0.60.40.2FLAGGAPDH

BOVH」

JOIQA-UOISSaldxQ050.0CON

NLRP3

O/EFLAGGAPDH

注:A

A549

NLRP3

O/E

组明显表达

FLAGGB

NCI-H460

NLRP3

O/E

组明显表达

FLAG.与对照组相比,*

P<0.21

图1检测NLRP3过表达慢病毒在肺癌A549、NC-H460细胞中的表达情况05CON

NLRP3

O/E2

NLRP3过表达对A549细胞的增殖起促进

作用，对NCI-H460细胞的增殖有抑制作用明显咼于CON组（均P<0.01）.

0

h时NCIH460

细胞O/E组和CON组的吸光度无明显差异，24、

细胞计数试剂盒8

（

Obio

Technology,

Shanghai,China）检测细胞增殖情况.如图2A、2B

48.2.6

h时，O/E组吸光度值均明显低于CON

组（均P<0.01）.以上结果说明NLRP3过表达促

进A549细胞的增殖，抑制NCI-H460细胞的增殖.所示,h时A549细胞O/E组和CON组的吸光度

无明显差异,4、48、72、96

h时,O/E组吸光度值均

A(Euos)寸注：NLRP3过表达增强A549细胞的增殖能力；B NLRP3过表达抑制NCI-H460细胞的增殖能力.与对照组相比,*

P<0.013

NLRP3过表达可增强A549细胞的迁移能

力,对NCI-H460细胞的迁移能力无明显

影响用划痕实验检测细胞迁移情况.如图3A所示,

6

h时A549细胞的O/E组和CON组迁移率差异

无统计学意义（P

=0.884）,4

h时O/E组细胞迁移

(Euos)寸a。Oh图2NLRP3过表达对肺癌-H460细胞增殖能力的影响率咼于CON组（P

=0.02）.如图3B所示，NCI

H460

O/E

组和

CON

组在

6

h（P

=

0.797

）、24

h

（P

=

0.885）迁移率差异均无统计学意义.因此

NLRP3过表达可对A549细胞的迁移能力有促进作

用，对NCIH460细胞的迁移能力无明显影响.a。

480Labeled

Immunoassays

&

Clin

Med,

Mar.2021, Vol.28

,

No.3(-3抿.!

aOUTJ-UJ

NLRP3

O/EOhBCON6h

24h-r-oh=396h24110(-3抿86.!

OaUTJ-UJ

420Oh

6h

24hNLRP3

O/E=39Oh6h24h注：A NLRP3过表达增强A549细胞的迁移能力；B NLRP3过表达对NCI-H460细胞迁移能力无明显影响.与对照组相比,

P

005图3

NLRP3过表达对肺癌-H460细胞迁移能力的影响4

NLRP3过表达对A549细胞的侵袭能力有

促进作用，对NCI-H460细胞的侵袭能力无

明显影响侵袭细胞数明显咼于CON组侵袭细胞数（P

<

0.01）,即NLRP3过表达可增强A549细胞的侵袭能

力.如图4B所示,NCI

H460细胞的O/E组与

CON组侵袭细胞数差异无统计学意义（P

=

0.09）,

TranswelKCorning）侵袭实验检测细胞的侵袭

能力.如图4A所示，结晶紫染色24

h后统计分析

进入小室的细胞数量可以发现，A549细胞O/E组

以上结果说明NLRP3过表达对NCIH460细胞的

侵袭能力无明显影响.5=30P3PEA

.S

注:A NLRP3过表达增强A549细胞的侵袭能力；B NLRP3过表达对NCI-H460细胞侵袭能力无明显影响.与对照组相比,*

P<0.21图4

NLRP3过表达对肺癌-H460细胞侵袭能力的影响J0JQquJnN0CON5=30P3PEANLRP3

O/E

.S

J0JQquInN5

NLRP3过表达对A549细胞的早期凋亡有抑

制作用，对晚期凋亡无明显影响；NLRP3过表

学意义（P=0.38）.如图

5B

所示,NCI-H460

O/E

组和CON组细胞的早期凋亡率（P

=

0.588）和晚期

达对NCI-H460细胞的凋亡无明显影响凋亡率（P

=0.176）差异均无统计学意义.以上结果

表明NLRP3过表达抑制A549细胞的早期凋亡，对

晚期凋亡无明显影响；其过表达对NCIH460细胞

流式细胞技术定量检测细胞凋亡情况.如图

5A所示,A549

O/E组细胞早期凋亡率明显低于

CON组（P<0.01）,晚期凋亡率两组的差异无统计

的凋亡无明显影响.

标记免疫分析与临床

2021年3月第28卷第3期481Q2-14.13%Q2-26.72%Q2-12.43%Q2-27.78%虧Q2-40.34%CON289.4%Q2-40.33%10-01

102

103

104

105

105

107■»

7-AADNLRP3

O/E108启**启64注:A NLRP3过表达抑制A549细胞的早期凋亡.对A549细胞晚期凋亡无明显影响；B

NLRP3过表达对NCI-H460细胞早期凋亡和

讨

论NLRP3作为炎性小体的重要功能成分，与效应

蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)和衔接

蛋白凋亡相关斑点样蛋白(ASC)共同调节免疫细胞

中II-邛和II-18的成熟来发挥生物学效应[1].

NLRP3

炎性小体的激活与

多种

因

素

有

关,

其激活即

可以促进肿瘤的进展也可以抑制其发展过程，主要

和参与炎症反应的免疫细胞活性及机体的内环境有

关.已有研究表明,NLRP3炎性小体激活介导的

-oldodEaijew

-oldod20

_1_!-CON0NLRP3

O/EQ2021.15%NLRP3

O/EQ2-10.25%Q2-20.76%Q2-10.20%害CONr'F■

整oQ2-4Q2-38HZ%90.58%"-1014

103

104

105

106

1071Q2-3

91.94%-io1-4

'Q2-47.05%104

105

106

1071103

7-AADNLRP3

O/E1.50.32

工OCONNLRP3

O/E晚期凋亡均无明显影响。与对照组相比,*F<0.01图5

NLRP3过表达对肺癌A549、NCI-H460细胞凋亡能力的影响II-18分泌可诱导NK细胞对小鼠肝脏转移性结肠

癌细胞的杀伤活性，这主要归结于II-18对肠道细

胞的增殖、成熟、死亡、肠道上皮细胞愈合的调节以

及对肠道正常微生物群的维持作用[12]0

NLRP3炎

性小体的激活对胃癌、纤维肉瘤、黑色素瘤等肿瘤的

进展是有害的，这与不同肿瘤细胞和组织的特异性

有关而NLRP3过表达对肺癌发生发展的影响

尚不清楚.在文献综述的基础上，我们构建了

NSCLC

A549

细胞和

NCI-H460

细胞的

NLRP3

过

482表达模型,旨在探讨NLRP3过表达对两种类型肺癌

Labeled

Immunoassays

&

Clin

Med,

Mar.2021, Vol.28,No.3综上所述,NLRP3过表达增强A549细胞的增

殖、迁移、侵袭能力，抑制早期凋亡;NLRP3过表达

对NCIH460细胞的增殖能力有抑制作用。这些结

果表明NLRP3过表达可能通过不同信号通路影响

同种肺癌不同细胞系的生物学行为，肺癌的发展也

细胞生物学行为的影响。肿瘤细胞的生长和转移不受控制主要是由于正

常的细胞信号通路遭到破坏。Akt和ERK1/2是与

肿瘤增殖相关的两个重要信号分子。Akt主要通

过磷酸化多种底物对细胞的基本功能起调节作用,

ERK1/2主要影响细胞表面至细胞核的信号通路来

与癌细胞和癌组织的特异性相关。NLRP3影响肺

癌发展的具体信号通路有待进一步探索。参考文献[1

]

FERLAY

J,

SOERJOMATARAM

I,

DIKSHIT R,

et

al.调节肿瘤细胞的增殖［15］,两种信号分子调节细胞信

号通路的过程中也相互关联［61］。据报道，阻断II-18

或II-邛可减弱活化的NLRP3炎性小体对A549细

Cancer

incidence

and

mortality

worldwide:

sources,

methods

胞增殖和迁移的影响，表明II-18和II-邛均可以

促进肺癌的进展［5］。另外，NLRP3对肾脏缺血再灌

注损伤起显著保护性作用而不受炎性小体的影响,

表明NLRP3可独立于炎性体途径而发挥作用；而

且，NLRP3可不依赖于NLRP3炎性体途径增强转

化生长因子叩(TGF叩)诱导的肾脏上皮细胞向间质

转化的进程［8］。本研究发现,NLRP3过表达促进肺癌A549细

胞的增殖，对NCIH460细胞的增殖有抑制作用。

其过表达增强A549细胞的迁移、侵袭，抑制A549

细胞的早期凋亡。NLRP3过表达对NCIH460细

胞的迁移、侵袭、凋亡均无明显影响。这些结果表

明，同种肺癌的不同病理类型肿瘤细胞和组织的特

异性存在差异，导致NLRP3过表达对NSCLC

A549、NCIH460细胞的生物学行为影响不同，具体

机制有待进一步探究。在第6小时，NSCLC

A549细胞的CON组和

O/E组迁移能力无明显差异，可能原因为第6小时

两组细胞尚未达到最佳运动状态。细胞凋亡为基因

控制的细胞自主有序的主动死亡过程，凋亡过程的

确切机制目前尚不完全清楚。研究表明，以下机制

与肺癌细胞的凋亡有关肺癌细胞在细胞凋亡信

号转导机制上存在异常；肺癌细胞Fas基因表达水

平的下调使肿瘤细胞逃避T细胞的细胞毒作用；肿

瘤浸润的淋巴细胞(tumor

infiltrating

lymphocytes,

TIL)受肿瘤细胞诱导作用而发生凋亡，可使肿瘤细

胞逃避机体免疫监视。NLRP3过表达可能与以上

细胞凋亡机制相关，从而影响A549细胞的早期凋亡

而对其晚期凋亡无明显影响。非小细胞肺癌的病理类型中肺鳞癌比较常见,

今后需要进一步验证NLRP3过表达对肺鳞癌细胞

生物学行为的影响。以上实验在体外进行，后期进

一步行动物体内实验，以验证在活体生物中NLRP3

过表达对不同病理类型的肺癌生物学行为的影响。and

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