高效液相色谱法测定卤牛肉中苯甲酸含量的不确定度评估

2024年11月13日发(作者：)

分析检测

高效液相色谱法测定卤牛肉中苯甲酸含量的

不确定度评估

王珊珊，赵雯玮

*

，王文巧

（西藏自治区食品药品检验研究院，西藏拉萨 850000）

摘 要：本实验采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定卤牛肉中

苯甲酸的含量，并进行不确定度评估，结合数学模型与实验全过程，确认苯甲酸标准系列溶液配制、样品

处理、标准曲线拟合、仪器测定4个过程为不确定度的主要来源，通过分析、计算，得到苯甲酸的含量为

0.215 4 g·kg

-1

，其扩展不确定度为0.018 5 g·kg

-1

，苯甲酸含量可以表示为（0.215 4

±

0.018 5）g·kg

-1

（

k

=2，置信

区间95%）。此外，对上述4个过程的不确定度进行比较，发现标准曲线拟合过程引入的不确定度是总不确

定度的主要来源，系列标准曲线配制过程和仪器测定对不确定度的影响相当，样品制备过程的影响较小。本

实验为此类食品苯甲酸含量测定的不确定度评估提供依据。

关键词：高效液相色谱法；卤牛肉；苯甲酸；不确定度

Evaluation of Uncertainty in Determination of Benzoic Acid in

Braised Beef by HPLC

WANG Shanshan, ZHAO Wenwei

*

, WANG Wenqiao

(Tibet Autonomous Region Food and Drug Inspection Research Institute, Lhasa 850000, China)

Abstract:

This experiment used high performance liquid chromatography (HPLC) to determine the content

of benzoic acid in braised beef, and evaluated the uncertainty. Combining mathematical models and the entire

experimental process, it was confirmed that the preparation of benzoic acid standard series solution, sample

processing, standard curve fitting, and instrument measurement were the main sources of uncertainty. Through

analysis and calculation, the content of benzoic acid was 0.215 4 g·kg

-1

, Its expanded uncertainty is 0.018 5 g·kg

-1

,

and the benzoic acid content can be expressed as (0.215 4±0.018 5) g·kg

-1

(

k

=2, confidence interval 95%). In

addition, comparing the uncertainty of the four processes mentioned above, it was found that the uncertainty

introduced by the standard curve fitting process is the main source of total uncertainty. The influence of the series

standard curve preparation process and the instrument measurement process on uncertainty is similar, while the

influence of the sample preparation process is relatively small. This experiment provides a basis for evaluating the

uncertainty of the determination of benzoic acid content in such foods.

Keywords:

high performance liquid chromatography; spiced beef; benzoic acid; uncertainty

苯甲酸作为最常见的防腐剂，能够抑制霉菌、

酵母和细菌，起到延长食品保质期的作用。然而，

部分商家在肉类卤制过程中会过量添加此类食品添

加剂，对人体造成不良影响。研究表明，过量食用

苯甲酸会影响摄入者肠胃消化酶的正常分泌

[1-2]

，降

低小肠的吸收能力，使食欲减退，另外食用苯甲酸

有致癌和遗传伤害可能性

[3]

。

测量不确定度是根据检验信息，表征赋予被测

基金项目：西藏自治区科技厅计划项目（XZ202001ZY0058G）；西藏自治区食品药品检验研究院科研项目（XZSYJY-

YJKYXM-2020-02）。

作者简介：王珊珊（1990—），女，河南安阳人，硕士，助理工程师。研究方向：食品营养、食品理化检测。

通信作者：赵雯玮（1978—），女，河南安阳人，硕士，高级工程师。研究方向：食品安全检验与食品营养成分分析。

E-mail:***************。

Dec. 2023

CHINA FOOD SAFETY

79

分析检测

量值分散性的非负参数

[4]

，本文对HPLC法测定卤

牛肉中苯甲酸含量的方法进行系统分析，识别测定

过程中的不确定来源，建立数学模型，计算测定结

果的合成标准不确定度和相对标准不确定度，为同

类项目测定结果的不确定度评价和分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

卤牛肉，市场随机购买的阳性样本。

苯甲酸标准物质储备液：GBW(E)100006

22001，中国计量科学研究院；亚铁氰化钾：分析纯，

成都市科龙化工试剂厂；乙酸锌：分析纯，成都市

科隆化学品有限公司；乙酸铵：色谱纯，天津市科

密欧化学试剂有限公司；甲醇：色谱纯，赛默飞世

尔科技有限公司。

Agilen-1260 液相色谱仪，美国安捷伦公司；

XP203S电子分析天平，瑞士梅特勒公司；P300H超

声波清洗仪，德国Elma；ST1L台式高速离心机，英

国赛默世尔；DMT-2500多管涡旋混合仪，中国江

苏盛蓝。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

按照《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨

酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）

[5]

第一法

液相色谱法规定过程，处理样品。

样品加标：取2 g（精确到0.001 g）样品于离心

管中，加入浓度为1 mg·mL

-1

的苯甲酸储备溶液

0.4 mL，苯甲酸加标量为0.4 mg，同样品处理方法处

理后，过膜待上机测定。

1.2.2 苯甲酸系列标准溶液的配制

40

μ

g·mL

-1

苯甲酸中间液的配制：吸取

1.00 mg·mL

-1

苯甲酸储备液1.00 mL于25 mL容量瓶

中，用水定容。

苯甲酸系列标准溶液的配制：分别准确吸取

40

μ

g·mL

-1

苯甲酸中间液0.125 mL、0.500 mL、

1.000 mL、2.000 mL、3.000 mL、4.000 mL和

5.000 mL于10 mL容量瓶中，用水定容。配制成质

量浓度为0.500

μ

g·mL

-1

、2.000

μ

g·mL

-1

、4.000

μ

g·mL

-1

、

8.000

μ

g·mL

-1

、12.000

μ

g·mL

-1

、16.000

μ

g·mL

-1

和

20.000

μ

g·mL

-1

的标准系列工作溶液。

1.2.3 液相色谱条件

流动相：甲醇∶乙酸铵（0.02 mol·L

-1

）=5∶95

V

∶

V

）等度洗脱；色谱柱：Eclipse Plus C

18

250 mm

×

4.6 mm，5

μ

m）；进样量10

μ

L；流速：

80

食品安全导刊 2023年12月（下）

1.00 mL·min

-1

；检测波长：230 nm；柱温：30

℃

。

2 不确定度评定

2.1 建立数学模型

苯甲酸含量计算公式为

X

=

C×V

m×1 000

（1）

式中：

X

为试样中苯甲酸的含量，g·kg

-1

；

C

为

标准曲线得出的试样中苯甲酸的含量，

μ

g·mL

-1

；

V

为试样定容体积，mL；

m

为试样质量；g；1 000

为换算因子。

2.2 不确定度主要来源分析

从样品处理测定总流程和数学模型考虑，卤牛

肉中苯甲酸的不确定度主要来源如图1所示。

标准溶液配制引入的不确定度

标准物质本身的不确定度

系列标准溶液配制

引入的不确定度

标准曲线拟合引入的不确定度

中间液配制引入的不确定度

苯甲酸含量测定的不确定度

样品称量引入的不去认定度

样品定容引入的不确定度

样品引入的不确定度

仪器测定引入的不确定度

样品制备引入的不确定度

图1 不确定度来源分析图

2.3 不确定度的计算

2.3.1 苯甲酸系列标准溶液配制过程引入的相对标

准不确定度

u

rel

(

S

)

（1）苯甲酸标准物质引入的相对标准不确定度。

证书显示：苯甲酸溶液标准物质标准值1.00 mg·mL

-1

；

相对扩展不确定度为2%（

k

=2），则使用苯甲酸标准

溶液引入的相对标准不确定度为

u

rel

(

C

)=2%

÷

2=0.01。

（2）40.00 µg·mL

-1

苯甲酸中间液的配制引入的

相对标准不确定度。苯甲酸中间液的配制使用了

1.00 mL移液管和25 mL容量瓶，因使用量器引入的

不确定度计算过程相同，本文以1.00 mL移液管的不

确定度计算为例，其他量器的不确定度计算不再赘

述，并将结果汇总如表1。

1.00 mL移液管引入的不确定度计算：经查

阅移液管校准证书，其准确度等级均为A级，

容量允许差为

±

0.01 mL

[6]

，按照均匀分布，取

k=3

，使用1.00 mL移液管引入的标准不确定度

为

u

(

V

0.01

11

)

=

3

=

0.005 77 mL

。

设移取液体时的温度与校准要求温度的差异为

±

5

℃

，水的膨胀系数为2.1

×

10

-4

℃

-1

，因温度差异引

入的体积变化为

±

(1.00

×

5

×

2.1

×

10

-4

)=

±

0.001 05 mL，

（

（

分析检测

表1 使用量器引入的不确定度汇总表

量器级别允差

1.00 mL移液管A级

±

0.01 mL

5.00 mL移液管A级0.025 mL

25 mL容量瓶A级

±

0.03 mL

10 mL容量瓶A级0.020 mL

50 mL容量瓶A级

±

0.05 mL

按均匀分布，

k=3

，吸取液体时温度差异引入的标

准不确定度为

u

0.001 05

2

(

V

1

)

=

3

=

0.006 06 mL

。

综上，使用一次1.00 mL移液管引入的标准不确

定度为

u

(

V

1

)

=u

1

2

(

V

1

)

+u

2

2

(

V

1

)

=

0.005 77

2

+

0.000 606

2

=

使用一次

0.005 80 mL

1.00 mL移液管引入的相对标准不确定

度为

u

rel

(

V

1

)

=

u

(

V

1

)

V

=

0.005 80

=

0.005 80

1

1

。

由表1可知使用一次25 mL容量瓶引入的

标准不确定度和相对标准不确定度分别为

u

(

V

25

)=

0.023 0 mL、

u

rel

(

V

25

)=0.000 92。

苯甲酸中间液配制过程引入的相对标准不确定

度为

u

22

rel

(

C

40

)

=u

rel

(

V

1

)

+u

rel

(

V

25

)

=

0.005 80

2

0.000 92

2

　　　　　+=

0.005 87

苯甲酸系列浓度标准溶液配制过程中引入的不

确定度。苯甲酸系列浓度标准溶液配制过程分别用

到了1.00 mL移液管3次、5.00 mL移液管4次和

10 mL容量瓶7次。该过程引入的标准不确

定度为

u

rel

(

C

1

)

=

3

u

2

rel

(

V

1

)

+

4

u

2

rel

(

V

5

)

+

7

u

2

rel

(

V

10

)

=

3

×

0.005 80

2

+

4

×

0.000 294

2

+

7

×

0.001 30

2

=

苯甲酸标准物质配制过程引入的相对标准不确

0.010 6

定度为

u

rel

(

S

)

=u

2

rel

(

C

)

+u

2

rel

(

C

40

)

+u

2

rel

(

C

1

)

=

2.3.2

苯甲酸标准曲线拟合引入的相对标准不确定

0.01

2

+

0.005 87

2

+

0.010 6

2

=

0.015 7

度

u

rel

(

X

)

苯甲酸标准系列浓度溶液经安捷伦高效液相色

谱仪收集并积分，得到各浓度点

x

与其相对应的峰面

积

y

，浓度和峰面积拟合的线性回归方程为

y

=

ax

+

b

（

a

为斜率，

b

为截距），测定结果如表2所示。

标准不确定度相对标准不确定度

u

(

V

1

)=0.005 80 mL

u

rel

(

V

1

)=0.005 80

u

(

V

5

)=0.147 7 mL

u

rel

(

V

5

)=0.000 294

u

(

V

25

)=0.023 0 mL

u

rel

(

V

25

)=0.000 92

u

(

V

10

)=0.013 0 mL

u

rel

(

V

10

)=0.001 30

u

(

V

50

)=0.041 9 mL

u

rel

(

V

50

)=0.000 838

根据贝塞尔公式

[7]

，得到苯甲酸标准曲线的剩

余标准偏差为

n

[

y

−

(

ax

S

i

+

b

)]

2

A

=

∑

i

=

1

i

（2）

n

−

2

本次实验对两套标准溶液进行了测定，苯甲酸

标准溶液平均浓度为

—

C

标

=8.93

μ

g·mL

-1

。苯甲酸标准

曲线的不确定度为

u

(

X

)

=

S

A

1

ap

+

1

(

C

样

−

C

标

)

2

n

+

∑

n

(

C

（3）

j

−

C

标

)

2

j

=

1

式（2）和式（3）中：

a

=21.965，

b

=-6.269 2，

p

=14

14次测量）；

n

=14（7个浓度的标准样

14

品分别测定2次）。

∑

(

C

j

−

C

标

)

2

=652.42

j

=

1

。则

n

y

−

(

ax

S

i

+

b

)]

2

A

=

∑

[

i

=

1

i

n

−

2

=

18.418

u

(

X

)

=

S

A

11

(

C

样

−

C

标

)

2

ap

+

n

+

=

∑

n

(

C

j

−

C

标

)

2

j

=

1

18.41811

（8.78-8.93）

2

21.965

×

14

+

14

+

652.42

=

0.317 mg·L

-1

苯甲酸标准曲线拟合引入的相对标准不确定度

为

u

rel

（

X

）

=

u

(

X

)0.317

C

=

样

8.78

=0.036 1

。

2.3.3 样品处理过程引入的相对标准不确定度

u

rel

(

M

)

（1）称量过程引入的不确定度。经查阅检定证书，

样品的称量质量为2.0 g，在0.01 g≤

m

≤50.00 g范

围内时，天平最大允许误差为

±

0.000 5 g，天平引入

的不确定度呈均匀分布，天平的标准不确定度和相

对标准不确定度计算为

u

(

m

)

=

0.000 5

=

0.000 289 g

u

rel

(

m

)

=

u

(

3

m

)

m

=

0.000 289

2

=

0.000 145

（2）样品定容过程引入的不确定度。在样品处

Dec. 2023

CHINA FOOD SAFETY

81

（对标品进行

分析检测

理过程中用到了50 mL容量瓶，根据表1可知其

标准不确定度和相对标准不确定度分别为

u

(

V

50

)=

0.041 9 mL、

u

rel

(

V

50

)=0.000 838。

（3）样品处理过程引入的不确定度。在处理

的过程中，添加亚铁氰化钾和乙酸锌除蛋白以

及定容转移过程使得样品中苯甲酸不能全部收

至待测液中，苯甲酸的回收率在91.31%~99.71%

（表3），回收率的标准偏差为2.452%，处理

过程引入的标准不确定度与相对标准不确定度

分别为

u

(

R

)

=

S

(

R

)

=

2.452

10

=

0.775

u

rel

(

R

)

=

u

n

(

R

)

表

R

=

0.775

93.14

=

0.008 32

2 苯甲酸标准曲线数据表

标准物质浓度（/µg·mL

-1

）峰面积

y

拟合方程

0.500

11.824 23

10.355 71

2.000

36.621 31

40.131 13

4.000

81.408 36

84.395 62

8.000

168.254 33

y

=21.965

170.749 53

r

2

=0.996 3

x

-6.269 2,

12.000

252.578 67

220.637 18

16.000

340.660 40

353.123 54

20.000

436.614 75

450.528 02

表3 发酵面加标回收结果表

样品名

称样量

/g

峰面积

（/

样品浓度

μ

g·mL

-1

糖精钠含量

）

（/g·kg

-1

加标回收

）率/%

Y12.046187.2428.810.215 3093.22

Y22.034189.4398.910.219 0391.31

Y32.046185.9258.750.213 8393.96

Y42.037187.4628.820.216 4992.60

Y52.035188.1218.850.217 4492.12

Y62.046190.3188.950.218 7291.47

Y72.038188.1218.850.217 1292.28

Y82.019173.4058.180.202 5899.71

Y92.04187.0238.80.215 6993.02

Y102.034188.7808.880.218 2991.69

平均值2.038186.5808.780.215 4593.14

标准偏差0.008 144.5510.2180.004 652.452

（4）样品处理全过程中引入的合成相对标准不确

82

食品安全导刊 2023年12月（下）

定度为

uu

2

rel

(

m

)

+u

2

rel

(

V

50

)

+u

2

rel

(

M

)

=

rel

(

R

)

=

0.000 145

2　　　　　　　　　

+0.000 838

2　　　　　　　　

+0.008 32

2

=

2.3.4

　仪器测

0.008 36

定过程引入的相对标准不确定度

u

rel

(

Ap

)

高效液相色谱仪自身的不确定度和峰面积的重

复性测定引入的不确定度构成了仪器测定引入的标

准不确定度。

（1）高效液相色谱仪自身的不确定度。查阅仪器

的检定证书，其不确定度为3%，

k

=2，故仪器自身

引入的相对标准不确定度为

uAp

0.03

rel

(

1

)

=

2

=

0.013

（2）重复测定引入的相对标准不确定度。各样品

的峰面积结果见表2，重复测定（

n

=10）引入的标准不

确定度和相对标准不确定度分别为

u

(

Ap

=

4.5514.551

2

)

==

1.439

u

=

u

n

(

Ap

10

rel

(

Ap

y

2

)

2

)

=

1.439

186.580

=

0.007 71

（3）仪器测定引入的相对标准不确定度为

u

rel

(

Ap

)

=u

2

rel

(

Ap

1

)

+u

2

rel

(

Ap

2

)

=

2

2.3.5

合成标准不确定度

0.013

+

0.007 71

2

u

(

H

)与扩展不确定度

=

0.015 1

U

高效液相色谱法测定卤牛肉中苯甲酸含量的合成

相对标准不确定度计算为

u

rel

(

H

)

=u

2

rel

(

S

)

+u

2

rel

(

M

)

+u

2

rel

(

X

)

+u

2

rel

(

Ap

)=

0.0157

2

+

0.008 36

2

+

0.036 1

2

+

0.015 1

2

=

—

本次实

0.043 0

验测得卤牛肉中苯甲酸的平均含量

X

=0.215 4g·kg

-1

，其合成标准不确定度为

u

(

H

)=

—

X

×u

rel

(

H

)=0.215 4

×

0.043 0=0.009 262 g·kg

-1

当置信区间为95%时，包含因子为

k

=2，得到扩

展不确定度

U

=

k×u

(

H

)=2

×

0.009 262=0.018 5 g·kg

-1

高效液相色谱法测定卤牛肉中苯甲酸的含量结

果表示为

X

=（0.215 4

±

0.018 5）g·kg

-1

（

k

=2，置信区

间95%）。

3 结论

本次实验表明多次称量并测定可以有效避免取

样不均的问题，样品的处理过程对总不确定度的影

（下转第87页）

分析检测

表3　样品重复性测量结果

-1

重复性测量次数

p

测量浓度

C

样

（/

μ

g·L

-1

）样品中铝含量

X

（/mg·kg

-1

）样品中铝平均含量

X

（/mg·kg

-1

）

i

/

μ

g·L

）平均浓度

C

样

（

——

1

2

3

4

5

6

308.890

306.992

305.868

325.098

320.023

326.494

315.561

267

265

264

281

277

282

273

U

=

u

(

w

)

×k

=10.3

×

2=20.6≈21 mg·kg

-1

；根据本次不确

定评估，油条中铝含量的结果表示为

X

=273 mg·kg

-1

，

U

=21 mg·kg

-1

。

置合理的标准曲线范围，从而减小实验过程的误差，

确保数据的准确性和可信度。

参考文献

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农业机械,2012,7(21):76-79.

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Dec. 2023

CHINA FOOD SAFETY

4　结论与讨论

本研究应用电感耦合等离子体质谱法对油条中

铝的残留量进行测定。根据数学模型，对于检测过

程引入的各不确定度分量进行独立评定，对影响测

定结果的不确定度进行排序，由高到低为标准曲线

拟合的不确定度＞标准工作溶液配制过程的不确定

度＞样品重复测量过程的不确定度＞样品稀释过程

引入的不确定度＞样品称量过程引入的不确定度＞

样品定容引入的不确定度，其中标准曲线拟合及标

准工作溶液配制过程中多次引入移液枪、容量瓶和

温度波动等因素的不确定度，所以不确定度较其他

因素更大。在检测过程中应根据实际情况，减少使

用不同量程的器具，优先选用经计量检定合格，精

度高的移液器和容量瓶配制标准系列溶液，来提高

检测准确度。同时检测人员在定容、稀释过程中应

熟练操作，注意避免产生可能对检测结果有较大影

响的随机干扰因素。上机检测前优化仪器参数，设

（上接第82页）

响较小。主要不确定度来源为标准曲线的拟合，标

准苯甲酸系列溶液的配制和仪器的测定对总不确定

度的影响相当。在今后的实验中，选择纯度更高、

不确定度更小的苯甲酸标准物质，规范系列标准溶

液的配制操作，选择精密度较高、稳定性较好的测

量仪器可以有效提高测定结果的准确度。

参考文献

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