肉及肉制品中牦牛源性成分的PCR鉴别

2024年11月13日发(作者：)

肉及肉制品中牦牛源性成分的PCR鉴别

段庆梓;尚柯;张彪;张玉;王巍;梁恒兴

【摘 要】通过牦牛与其他常见物种的细胞色素b基因序列进行比对,设计牦牛的特

异性引物,并进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)体系中不同

条件、参数的考察,建立肉及肉制品中牦牛源性检测的PCR方法.该方法具有较好的

专属性,建立的PCR体系仅对牦牛源性有扩增现象,而对其他物种无扩增,且对牦牛

源性的检出限可达到1%.能够满足检验机构或生产企业对肉及肉制品中牦牛源性的

检测需求.%The specific primer of yak was designed by cytochrome b gene

alignment between yak and other common species, which was used to

establish the PCR detection of yak in meat products by Investigation of dif-

ferent conditions and parameters. The established PCR system had better

specificity, which could only have am-plification of yak, and not

amplification of other species. The detection limit of yak could reach to 1%.

The yak PCR system established could meet the demand of institutions or

production enterprises to detect the source of yak in meat and meat

products.

【期刊名称】《食品研究与开发》

【年(卷),期】2017(038)009

【总页数】4页(P157-160)

【关键词】肉制品;牦牛;聚合酶链式反应;分子鉴别

【作 者】段庆梓;尚柯;张彪;张玉;王巍;梁恒兴

【作者单位】成都市食品药品检验研究院,四川成都610045;成都市食品药品检验

研究院,四川成都610045;成都市食品药品检验研究院,四川成都610045;成都市食

品药品检验研究院,四川成都610045;成都市食品药品检验研究院,四川成都

610045;成都市食品药品检验研究院,四川成都610045

【正文语种】中 文

牦牛（Bog grunniens）是唯一能适应青藏高原及周边地区特殊生态环境且延续至

今的牛种，主要分布于我国的青藏高原地区，为广大藏区人民提供奶、肉、毛、役

力、燃料等生产、生活必需品，具有不可替代性，也是该区域草地畜牧业和民族经

济可持续发展的资源依托[1]。

牦牛肉作为一种高品质肉类，氨基酸含量丰富、种类齐全，营养成分显著高于其他

牛种[2]。近年来，随着旅游行业的快速发展，牦牛肉制品以其较好的营养价值和

独特的天然口感越来越受到消费者的青睐，但其市场价格与其他牛肉存在较大差异。

有报道曝光不良商家用黄牛肉、水牛肉甚至猪肉等肉质来冒充牦牛肉的情况，以次

充好，谋取暴利，欺骗消费者。因此，牦牛肉制品中牦牛成分的鉴别已成为亟需解

决的问题。

目前有研究通过对线粒体12sRNA进行基因扩增、序列比对和限制性内切酶长度

多态性反应来对黄牛、水牛、牦牛等物种进行鉴别[3-4]，虽然这些方法能够对牦

牛源性进行鉴别，但其操作过程复杂、结果判定的专属性不强，未能形成对牦牛源

性快速、准确的鉴别。动物线粒体脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）

作为高等动物唯一的核外遗传物质，与核基因组相比具有分子量小、结构简单、进

化速率快、多态性丰富、无重组和遵循母系遗传等特点，是一个比较理想的用于检

测的靶基因，并且在动物所有组织细胞中均含有大量线粒体，因此可以获得大量的

线粒体DNA[5-6]。早在20世纪90年代就有学者用细胞色素b（Cytochrome b，

Cytb）基因作为分子标记来进行肉源性的鉴别，即使在各种条件下处理过的肉制

品，也能通过Cytb基因的PCR扩增和序列比对的方法来进行鉴别[7-9]。

在本研究中，通过牦牛与其他常见物种Cytb基因的序列比对，设计牦牛特异性引

物，并对PCR体系中不同条件、参数的考察，最终建立了牦牛源性检测的PCR方

法。目的在于突破现有牦牛源性检测的局限性，在遗传本质上为牦牛源性提供一种

快速、准确、专属性强的鉴别方法。

1.1 样品与对照

生鲜牦牛肉：四川阿坝州马尔康市农贸市场；牦牛肉制品：西藏、青海、四川当地

超市货架；阳性对照（生鲜牦牛肉）：四川省阿坝州马尔康市场；阴性对照为常见

的动物肉样（黄牛、水牛、猪、绵羊、兔、鸡、鸭、马、小鼠、猫、狐狸、貉）：

中国检验检疫科学研究院；空白对照为灭菌的超纯水。

1.2 试剂

动物基因组提取试剂盒（GK0122）：上海捷瑞生物科技有限公司；2×PCR预混

液（K20420）：北京Transgene公司；DNA Marker：北京天根生物科技有限

公司；GoldView：北京百泰克公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

LS-P96GPCR仪：美国FisherScientific公司；5427R离心机：德国Eppendorf

公司；PowerPac Basic电泳仪：美国BIO-RAD公司；GelDoc凝胶成像仪：美

国UVP公司；ME2002E电子天平：瑞士特勒-托利多公司；P-330核酸蛋白仪：

德国IMPLEN公司；DK-420水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；GENIE 2涡

旋仪：美国IKA公司。

2.1 特异性引物的设计

研究选取线粒体DNA中的Cytb基因作为目标检测的靶基因，在GenBank数据

库中查找不同品种牦牛及常见动物（黄牛、水牛、猪、绵羊、兔、鸡、鸭、马、小

鼠、猫、狐狸、貉）的Cytb基因序列，并进行物种间的序列比对，在牦牛与其他

物种的DNA碱基差异区域设计牦牛特异性引物（见图1），用于牦牛的特异性检

测；所设计引物由上海生工进行合成，具体引物碱基序列见表1。

2.2 样品前处理及DNA提取

对不同种类的牦牛肉制品取样前须去除附着的调料及油脂，选取8个不同的瘦肉

部位进行取样，加入液氮，研磨成肉糜样，备用。在前处理过程中须使用灭菌的器

具进行操作，避免各批次样品之间的交叉污染。

称取前处理后的样品30 mg～50 mg，按试剂盒说明进行DNA提取，最终溶于

50 μL灭菌的超纯水中，-20℃保存备用。并对提取的DNA进行A260/A280值

测定，测定的A260/A280比值在1.8～2.0之间，DNA浓度在100 ng/μL～150

ng/μL。

2.3 牦牛特异性引物退火温度的考察

为确定牦牛特异性引物YAK-P和YAK-RP的最佳退火温度，进行了温度梯度的筛

选，分别设置退火温度为：56、58、60、62、64℃。PCR扩增均设置为30个循

环反应。

2.4 不同比例混合肉样的PCR检测

为确定牦牛源性鉴别PCR方法的灵敏度，研究设计了牦牛肉分别与猪肉、水牛肉

和黄牛肉不同比例混合的肉样进行PCR检测。即分别以猪肉、水牛肉和黄牛肉为

基质，相应添加1%、5%、10%、25%、50%的牦牛肉进行制样，充分混合均匀

后进行DNA提取，以混合样DNA为模板进行牦牛鉴别引物的PCR扩增。

2.5 牦牛源性PCR检测体系的方法学验证

Cytb基因在牦牛种内具有高保守的特点，该特异性检测可以对牦牛种内所有品系

进行鉴定。由于不同地区牦牛的基因组中存在多态性位点[10]，为避免牦牛多态性

位点存在于特异性引物的3'端，造成引物无法有效扩增的现象，利用牦牛特异性

引物与NCBI数据库中提交的牦牛品种Cytb基因进行比对（见图2），结果显示

牦牛特异性引物（YAK-P，YAK-RP）的3'端均位于牦牛序列的保守区，理论上证

明了所设计的牦牛鉴别特异性引物能够对所有牦牛品种实现PCR扩增。

本研究分别从西藏、青海、四川购买牦牛肉制品共计9个批次，进一步对所设计

的牦牛特异性引物及PCR检测体系进行适应性考察。

2.6 结果分析

对所有PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳，配制胶浓度为1.5%，并加入核酸染料

GoldView。电泳条件为120 V恒压电泳至凝胶中部，保存凝胶图谱以进行结果判

定。

3.1 PCR反应体系的建立

根据不同的退火温度分别对牦牛特异性引物进行PCR反应，结果如图3所示。

56℃～64℃均有牦牛源性的PCR扩增，退火温度为64℃时，扩增条带与其他温

度相比较弱，而56℃～ 62℃的扩增条带亮度较为一致，依据退火温度越高，引物

结合的特异性越好的原则，选择62℃为最佳的退火温度。

依据筛选的最佳退火温度，设定PCR反应程序为：94℃5 min，30个循环

（94℃30 s，62℃30 s，72℃30 s），72℃5 min。反应体系的体积为25 μL：

2×PCR混合液12.5 μL、正反向引物（20 μmol/L）各0.4 μL、模板DNA 1 μL，

灭菌超纯水补足25 μL。

3.2 牦牛源性试验对照的PCR结果

分别对牦牛阳性、阴性和空白对照进行PCR反应，结果如图4所示。

除牦牛能够扩增出301 bp的单一条带，其他物种均无条带扩增，以此来实现牦牛

与其他物种的鉴别。该结果表明所设计的特异性引物及建立牦牛源性PCR检测体

系的能够对牦牛源性进行准确鉴别，专属性较好。

3.3 不同比例混合肉样的PCR结果

不同比例混合肉样的PCR结果如图5所示。

在猪肉、黄牛肉和水牛肉中添加1%的牦牛肉时即被检出，PCR条带较弱，但随着

牦牛肉比例的增加，PCR条带的亮度也逐渐变量，与添加量的变化基本呈正相关。

该结果表明，所建立的牦牛鉴别PCR体系所能检出牦牛源性的检出限为1%，反

应体系的灵敏度较高。

3.4 牦牛源性PCR检测体系适应性的考察

分别取从不同产区购买的9批牦牛肉制品进行PCR反应，PCR产物经电泳后结果

如图6所示。

所购买的9批牦牛肉制品均出现与牦牛阳性对照一致的条带；表明所有样品都含

有牦牛源性成分。该结果表明所建立的牦牛特异性PCR鉴别体系对市场售卖的牦

牛肉制品有较好的方法适应性。

本研究依据牦牛与其他常见物种Cytb基因的碱基差异，设计了特异性引物，并建

立了牦牛源性检测的PCR反应体系，该体系能够对牦牛扩增大小为301 bp的条

带，而对其他物种无扩增，因此得以鉴别。通过进行牦牛与猪肉、水牛和黄牛不同

比例混合肉样的方法研究，该体系对牦牛源性的检测低限可达到1%。同时，建立

的牦牛特异性PCR鉴别体系对市售的牦牛肉制品有较好的方法适应性。

综上所述，本研究建立的肉及肉制品中牦牛源性成分检测的PCR体系，能够完成

对不同牦牛肉制品的特异性检测，且方法准确、快速，操作简便，适合作为检验机

构或生产企业用于牦牛源性成分的检测方法。

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